Окраска по Граму.

5. На обезжиренном предметном стекле делают мазки разных бактерий: в центре мазок исследуемой культуры, слева и справа – контрольных культур (рис.5), одна из которых должна быть грамположительной (Sarcina), другая – грамотрицательной (Escherichia coli). Мазки готовят, как и при простом способе (см. с. ).

6. На мазки наносят 2…3 капли раствора кристаллического фиолетового и через 2…3 мин окрашивания краску смывают водой.

7. Наносят 2…3 капли раствора Люголя и по истечении 1…2 мин смыва-ют водой (препарат чернеет).

8. Препарат обесцвечивают 0,5…1,0 мин 96%-ным этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1…2 мин водным фуксином. Препарат промывают водой, высушивают и

Рис.5. Схема приготовления препарата при окраске по Граму:

1 – мазок грамположительных бактерий; 2 – мазок грам-

отрицательных бактерий; 3 – исследуемая культура.

микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные – розово-красный цвет.

Цель занятия. Изучить правила пользования с иммерсионной системой микроскопа «Биолар-4». Усвоить технику приготовления препарата фиксированных окрашенных клеток простым и сложным способами.

Задание

1. Ознакомиться с правилами работы с иммерсионной системой микроскопа.

2. Промикроскопировать готовый препарат – «мазок» молочнокислых бактерий Streptococcus lactis с объективом 100х и зарисовать.

3. Приготовить, промикроскопировать и зарисовать препараты бактерий Sarcina, Micrococcus, Pseudomonas и Bacillus, окрашенных простым способом, с объективом 100х.

4. Промикроскопировать окрашенный по Граму готовый препарат бактерий, предложенный преподавателем, зарисовать и отметить их отношение к окраске по Граму с объективом 100х.

Оборудование и материалы. Микроскопы, флаконы с кедровым маслом, готовые окрашенные микробные препараты «мазок»), предметные стекла, красители – раствор фуксина, генциан-виолет, раствор Люголя, 96%-ный этиловый спирт, фильтровальная бумага – по числу студентов.

Контрольные вопросы

1. Что такое простые способы окраски препаратов и для чего их используют?

2. Какие способы окраски препаратов называют сложными и для чего их используют?

3. Что такое «Окраска по Граму» и где ее применяют?

4. Что такое иммерсионные объективы?

5. Зачем и как используют иммерсионное масло при работе с иммерсионным объективом?

Тема 2. Морфология микроорганизмов

Лабораторная работа 3.

«Изучение основных морфологических признаков бактерий»

Бактерии составляют наиболее обширную и разнообразную группу микроорганизмов. Большинство бактерий – это одноклеточные организмы с прокариотическим типом строения клетки. Размножение бактерий осуществляется путем поперечного деления клетки на две равные части. Клетки после деления могут разъединяться, однако, у некоторых видов остаются вместе, образуя различные сочетания.

В пищевых производствах встречаются бактерии шаровидной (рис.5) и палочковидной (рис.6) форм.

Шаровидные бактерии (кокки) по расположению клеток подразделяют на микрококки – клетки, расположенные одиночно; диплококки – клетки, соединенные по две; тетракокки – клетки, соединенные по четыре в виде тетраэдра; стрептококки – кокки, расположенные в цепочки различной длины; сарцины – скопления кубической формы, напоминающие пакеты; стафилококки – скопления клеток, напоминающие грозди винограда.

Рис.5. Шаровидные бактерии: а – микрококки; б - диплококки;

в – тетракокки; г – стрептококки; д – стафилококки;

е – сарцины

Диаметр шаровидных форм колеблется от 1,0 до 2,5 мкм. Шаровидные бактерии по Граму красятся положительно.

Палочковидные бактерии имеют цилиндрическую форму. Длина клеток колеблется от 2 до 5 мкм, иногда 10…12 мкм. Ширина колеблется от 0,5 до 1 мкм.

а б в г

Рис.6. Палочковидные бактерии: а – палочки без спор; б – спорообразующие бактерии

рода Bacillus; в , г – спорообразующие бактерии рода Clostridium.

Палочки могут быть соединены попарно или в цепочки. Палочковидные бактерии бывают неспорообразующие (рис.6а) и спорообразующие (рис.6 б, в, г). Среди палочковидных бактерий есть подвижные и неподвижные формы. Неспорообразующие палочковидные бактерии грамотрицательные (за исключением палочковидных молочнокислых бактерий), спорообразующие бактерии по Граму красятся положительно. Эндоспоры бактерий формируются при неблагоприятных для бактерии условиях, являются покоящимися формами и выполняют защитную функцию. Обычно спорообразование происходит при исчерпании питательных веществ в среде, а также при несоответствии температуры, рН, влажности и т.п. оптимальным условиям для развития бактерии. Цитоплазма и ядерное вещество в спорогеной зоне концентрируются и уплотняются. Проспора (уплотненное тельце) покрывается многослойной оболочкой и образуется спора. Эндоспоры отличаются низким содержанием воды. Ферменты споры находятся в неактивном состоянии. Споры в клетке могут располагаться центрально и латерально, не изменяя форму клетки. Такое расположение спор характерно для бактерий рода Bacillus (рис.6 б). Для бактерий рода Clostridium характерно изменение формы клетки (рис.6 в, г) при образовании эндоспоры, в результате клетка приобретает форму веретена или теннисной ракетки.

Когда спора сформируется, клеточная стенка и остальные части клетки разрушаются, а спора высвобождается.

Споры хорошо переносят высушивание , длительное кипячение и другие неблагоприятные воздействия, которые губительны для вегетативных клеток.

В клетке бактерий образуется только одна эндоспора, которая при благоприятных условиях вновь прорастает в одну вегетативную клетку, поэтому спорообразование у бактерий не является способом размножения.

Многие бактерии образуют капсулу снаружи клеточной стенки, представляющую скопление слизистого вещества (полисахариды, полипептиды). В зависимости от размера различают микрокапсулу и макрокапсулу. При микроскопировании капсулированных бактерий капсулы имеют вид бесцветного ореола (рис.7), окружающего клетки, так как вещество капсул слабо фиксирует краситель и легко отмывается в процессе обработки препарата.

Рис.7. Капсулообразующие Рис.8. Актиномицеты: а - мицелий; б – спороносцы.

бактерии

Чаще всего для выявления капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, накрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40х.

При этом на общем темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки бактерий, окрашенные в розовый цвет (рис.9).

К бактериям относится еще одна, встречающаяся в пищевых производствах особая группа микроорганизмов – актиномицеты (рис.8), которые также не имеют истинного ядра. Их клетки в основном имеют вид тонких длинных пря­мых ветвящихся нитей (рис.8а) и по внешнему виду похожи на клетки мицелиальных грибов. Актиномицеты обитают в воде, почве, попадают на растительные остатки и зерно, придавая им специфический землистый запах. Размножаются актиномицеты с помощью экзоспор, которые формируются на концах воздушного мицелия – спороносцах, последние имеют самую разнообразную форму (рис.8б). Актиномицеты являются грамположительными бактериями.

Цель занятия. 1.Закрепить технику приготовления и микроскопирования препарата- мазка.

2. Ознакомиться с некоторыми морфологическими особенностями бактерий, используя простые и сложные способы окрашивания и различные красители.