Окраска по Граму.

1. На обезжиренном предметном стекле делают мазки разных бактерий: в центре мазок исследуемой культуры, слева и справа – контрольных культур (рис.5), одна из которых должна быть грамположительной (Sarcina), другая – грамотрицательной (Escherichia coli). Мазки готовят, как и при простом способе (см. с. ).

2. На мазки наносят 2…3 капли раствора кристаллического фиолетового и через 2…3 мин окрашивания краску смывают водой.

3. Наносят 2…3 капли раствора Люголя и по истечении 1…2 мин смыва-ют водой (препарат чернеет).

4. Препарат обесцвечивают 0,5…1,0 мин 96%-ным этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1…2 мин водным фуксином. Препарат промывают водой, высушивают и

Рис.5. Схема приготовления препарата при окраске по Граму:

1 – мазок грамположительных бактерий; 2 – мазок грам-

отрицательных бактерий; 3 – исследуемая культура.

микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные – розово-красный цвет.

Контрольные вопросы

1. Из каких частей состоит микроскоп?

2. Каково назначение макро- и микрометрического винтов? Как ими пользоваться?

3. Что такое сухие и иммерсионные объективы?

4. Зачем и как используют иммерсионное масло при работе с иммерсионным объективом?

5. Как определяют общее увеличение микроскопа?

6. Как регулировать степень освещенности препарата?

7. Как готовить препарат «раздавленная капля»? С какими объективами его микроскопируют?

8. Как можно дифференцировать мертвые и живые клетки в приготовленной суспензии хлебопекарных дрожжей?

9. Что такое витальный способ окраски дрожжей? Для чего его применяют?

Лабораторная работа 2

Тема занятия:

Устройство оптического микроскопа типа «Биолар-4». Приготовление препаратов микроорганизмов (продолжение).

«Приготовление препаратов фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов. Правила работы с иммерсионной системой».

Препараты фиксированных окрашенных клеток

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание фиксацию и окраску. Способы окрашивания делят на простые и сложные. Различные способы окраски основаны на физико-химических особенностях микробной клетки и взаимодействии структур и веществ ее с используемыми реактивами.

При простых способах окрашивания используют один краситель. Простое окрашивание применяется для ознакомления с морфологией бактерий.

5. Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло наносят маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала. Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1-2см³ возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал почти тотчас же после приготовления.

6. Высушивание мазка. Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе или (для ускорения) в потоке теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх (не допуская нагрева стекла).

7. Фиксация. Цели фиксации: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске. Стекло с сухим мазком трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх.

8. Окраска. Охлажденный фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие над кюветой (рис.4), наносят 1…2 капли фуксина и, после выдерживания в течение 1…3 мин, смывают с него краску слабой струей воды из промывалки до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают, вначале осторожно промокая

фильтровальной бумагой, а затем –

на воздухе до полного его высыхания.

На препарат наносят каплю иммерсион-

ного масла и микроскопируют с объек-

тивом 100х.

Рис.4 Кювета с параллельными

рейками для окрашивания

препарата

При сложных способах окрашивания применяют два или более красящих вещества. Кроме красящих, используют различные обесцвечива-ющие вещества (спирт и др.). Такие способы окрашивания называют диф-ференциальными. Дифференциальныая окраска предполагает окрашивание определенных структур клетки. С ее помощью выявляют некоторые клеточные структуры, запасные вещества и включения.