14. Космидті векторлардың конструкциясы.

Космидтер - лямбда фагтың cos аймағы (жабысқақ ұштары) бар плазмида, яғни тіршілігі екі жақты ДНҚ-ның гибридті молекуласы. Оларды алғаш рет 1978ж Дж. Коллинз бен Б.Хон ашты. Космидтің плазмидалық бөлігі оның бактерияларда репликацияланына мүмкіндік береді, ал лямбда фактың геномына жататын бөлігі - cos тізбек - космидтің фаг капсидінің ішіне in vitro жағдайында оралуына және реципиенттік клеткаға трансдукциялануына мүмкіндік береді. Сонымен, космидтер клеткаға трансформация жолымен емес, кәдімгі инфекция арқылы ене алады. Мұның өзі трансформация процесінің тиімділігін ең аз дегенде 100есе арттырады. Жиі кездесетін космидті векторлар 4-6 м.ж.н тұрады, сол себепті Космидтік векторларда мөлшері 33-49 мың ж.н. бөліктен ДНҚ фрагменттерін көбейтуге болады. Космидтер сыйымдылығы ең үлкен векторлар, сондықтан эукариоттық ДНҚ-ның үлкен фрагменттерінің көшірмелерін және геномның гендер банкін(жинағын) клондардың барынша аз санымен алу үшін арнайы құрастырылған.

Клондаушы космидті вектордың негізгі компоненттері:

• ДНҚ репликациясы және детерминанттың антибиотикке тұрақтылығы басталуы үшін плазмидалық бөлігі;

• ДНҚ фрагментін клондауға жарамды бір немесе біршене рестриктазалармен гидролизденетін аймақтардың бірлік саны;

• Лямбда фагының ковалентті байланысқан жабысқақ ұштары бар ДНҚ фрагменті.

Космидті векторлар геномының библиотекасында лямбда фагтық векторларына негізделген гендік библиотекаларға қарағанда клон саны азырақ болады.

Қазіргі кезде прокариоттық және эукариоттық гендер библиотекасын құрастыруда қолданылатын космидалардың кең спектрі белгілі.

СУРЕТ КЕРЕК !!!!!!

15.Ұзын днқ кесінділерін клондауға арналған жасанды хромосомалар (yac-вектор).

Ашытқы жүйесіндегі жасанды хромосомалар ҮАС ДНҚның үлкен фрагменттерін клондауға арналған. Мысалы 100м.ж.н.астам ДНҚ кесіндісін клондауға арналған. Кейін олар ашытқы клеткасында жеке хромосома ретінде орналасады.

ҮАС векторының жүйесі өте тұрақты болып келеді. Оның көмегімен адамның ДНҚ геномының физикалық картасын және транскриптондардың үлкен анализін жүргізген, адамның индивидуалдық ДНҚ хромосомасы бар геномдық библиотекаларды құрастырған.

ҮАС векторы хромосомаға өте ұқсас болып келеді, өйткені алу құралы ДНҚ репликациясының инициациясының бастаушы тізбек сайты, ашытқы хромосомасының центромерлі ауданының сегменті және теломерлер қызметін атқарушы тізбектер болады. Теломерлер хромосоманың тұрақтылығына жауапты.

Бөтен ДНҚны ҮАС векторға енгізген кезде маркерлік гендерінің оқылу аясында ауытқулар болады. Соның нәтижесінде арнайы қоректік ортада клеткалар өсіргенде сол геннің белоктық өнімі түзілмейді. Ортада түрлі-түсті реакцияларды байқаймыз.

Кейбір ҮАС векторлардың құрамында клондау сайттарынан тәуелсіз селективті маркерлер болады. СУРЕТ КЕРЕК!!!

16. РНҚ-лы онкогендік вирустардың (ретровирустар) ұйымдасу ерекшеліктері. Онкогендік вирустар негізіндегі векторлар.

Молекулалық клондаушы векторлар гендік инженерлік тәжіриебелерді жүргізуде ерекше орын алады. Прокариот және төменгі сатыдағы эукариот клетка культураларында генетикалық ақпаратты тасымалдау үшін вектор ретінде плазмидалар мен вирустардың ДНК-сын қолданады.

Сүтқоректілердің клетка культураларынан эндогенді плазмидалар табылмағандықтан, көптеген зерттеуші ғалымдардың назарын құрылысында ДНК-сы бар вирустар өздеріне аударып отыр.

Ретровирустық векторлар

Нысана-клетка: фибробласттар, эндотелиальді клеткалар, миобласттар, бірыңғай салалы бұлшықет клеткалары, гепатоциттер, гемапоэтикалық клеткалар мен бағана клеткалар.

Артықшылықтары:

• Патогенді емес;

• Қожайын клетка геномына интегрирленеді;

• Жұмыс істеу оңай, манипуляция жүргізу қарапайым болып келеді;

• Биологиясы жақсы зерттелінген.

Кемшілігі:

• Вирустық титры төмен;

• Трансгенді енгізу сыйымдылығы шектеулі болып келеді: шамамен алғанда 10 мың жұп нулеотид;

• Бөлінбейтін клеткаларды зақымдамайды (инфекцияламайды);

• In vivo жағдайында терапиялық мақсатта қолдануға қолайсыз;

• Гендердің экспрессиялануы ұзаққа созылмайды.

Ретровирустық векторлар трансгенді жануарлармен жұмыс жасағанда қолданылады.

Ретровирустық векторлардың генетикалық ақпаратты тасымалдау сыйымдылығы үлкен емес, шамамен 9 мың жұп нуклеотидке дейінгі ДНК кесіндісін тасымалдай алады.

200-ден астам пациенттермен жүргізілген клиникалық зерттеулердің нәтижесінде репликация бойынша ретровирусттық векторлар ешқандай зиянды әсер көрсетпейтіндігі анықталған. Сонда да осы ретровирустық векторларды практикада қолдану қауіпсіздігі әлі де ғалымдарды ойландырып келеді.

Құрылысына 5'-LTR-промотордың бақылауындағы ретровирустың gag және pol гендері, цитомегаловирустық промотордың бақылауындағы терапевтический ген мен еnv гені бар плазмовирус деп аталатын қондырғы құрастырылған.

Вектор 3,5 мың жұп нуклеотидке дейінгі ДНК кесіндісін тасымалдай алады. Көптеген терапевтік кДНК мен ісік ауруларының супрессорлары гендерінің ұзындығы – 0,5–2 мың жұп нуклеотидті құрайды.

Ретровирустық векторлық жүйесіне қосымша өзгертулер енгізілген: түзілетін вирустық бөлшектердің саны көбейтілген, трансдукция эффективтілігі жоғарылатылған, бөлінбеген клеткаларға енуін қамтамасыз ететін гендік иженериялық модификация жүргізілген, инфекциялау спецификасы жоғарылатылған.

Рекомбинантты ретровирустық вектордың геномын басқа вирустың қабығына қаптайды, сол қаптаған вирустың белогы ретровирус пен ол зақымдайтын клеткалармен байланысу ерекшелігін арттырады. Бұл құбылысты фенотиптік араласу (pseudotype formation) деп атайды.

Фенотиптік араласқан вирустарды gag және pol гендерінің өнімі мен рекомбинантты ретровирустық вектор мен бөгде вирустың env генін экспрессиялаушы векторлардың клеткалық линиялардың котрансфекциясы көмегімен алады.

Env генін өзгерте отырып вирус зақымдайтын клеткалар тізімін таңдамалы түрде бір немесе бірнешеден көптеген клетка спектріне дейін арттыруға болады. еnv геніне белгілі бір клетка рецепторымен байланысушы пептид генін орналастыру арқылы қажет клетканы инфекциялауға болады.