40. Өсімдік клеткаларын және протопластарды трансформациялау әдістері.

Генетикалық материалды өсімдік клеткаларына енгізу әдістері:

1.клеткаларды агробактериялармен бірге өсіру

2.протопластарға ДНҚ-ны ПЭГ және Са²⁺ көмегімен енгізу

3.ДНҚ-ны липосомаларға салып тасымалдау

4.электророрация

5.электрофорез

6.микроинъекция

7.баллистикалық әдіс

Қосжарнақты өсімдіктерге агробактериялардың ауру жұқтыруы табиғатта кең таралған. Практикада in vitro жағдайында жүргізіледі. Өсімдіктерге бөтен ген енгізу арқылы пайда болған жаңа қасиеттер Мендель заңдары бойынша тұрақты тұқым қуалайды. Вирулентік агробактерияларды протопласттармен бірге өсіргенде трансформация өту үшін клетка қабығы қайта құрылуы қажет. Бұл құбылыс клетка қабығының түзілуін тежейтін заттарды қолдану және бактериялардың протопластарға қосылуын тежейтін ЭДТА қолдану арқылы дәлелденген.

Протопластарды бактериялардың сферопластымен(қабығы жоқ) бірге өсіру.

Қызғылт қабыршөптің протопластары агробактериялардың октопиндік Ті плазмидасы бар сферопластымен ПЭГ және поливинил спиртінің көмегімен қосылған. Одан кейін протопластар гормоны жоқ ортаға көшірілген. Өсіп шыққан клетка колонияларында октопиннің түзілетіндігі анықталған, яғни клетка хромасомасының құрамында Т-ДНҚ болғандығы дәлелденген.

Протопластарға ПЭГ және Са²⁺ көмегімен Т-ДНҚ –ны тікелей енгізу тәжірибелері жасалған.Трансформацияланған клеткалар гормоны жоқ ортада өсіріліп сұрыпталған.

ДНҚ протопластарға тасымалданғанда оны қорғау үшін ДНҚ-ны липосомаларға (фосфолипидтердің шар тәрізді жасанды денешіктері) салады, әйтпесе клеткадағы нуклеаза ферменттері оны ыдыратып жібереді. Протопластар фюзоген көмегімен липосомалармен оңай қосылады немесе эндоцитоз арқылы ішіне сіңеді.

Канамицинге төзімділік гені бар плазмида теріс заряды бар липосомаларға салынып ПЭГ көмегімен темекінің мезофильдік протопластарымен қосылған. Канамицинге төзімді клеткалардан трансформацияланған регенерант өсімдіктер алынған. Бұл әдістің артықшылығы, арнайы ДНҚ молекуласын құрастырудың қажеті жоқ, ал кемшілігі - трансформациялау жиі өтпейді.

Электропорация – клетка мембранасын электр тогымен тесу. Көбінесе жоғары кернеуі бар (1-2кВ/см) өте қысқа мерзімде (10^-3сек) өтетін разрядты қолданады. Электропорация әдісімен гендер тасымалдану нәтижесін 1-2тәуліктен кейін байқауға болады.

Микроинъекция – өсімдік клеткаларына ДНҚ ерітіндісін құ№ үшін сыртқы диаметрі 2мкм инелер мен арнаулы микроманипулятор қолданылады. Әр протопластқа инъекция жасалатын ДНҚ ерітіндісінің көлемі 10^-8 – 10^-9мл болады. Темекінің жапырақ мезофилінің протопластарына канамицинге төзімділік гені бар плазмидалар инъекция арқылы енгізілген.содан кейін протопластар 0,5-1мм микроколлониялар болып көбейгенше әдеттегі ортада өсіріледі.кейін канамиці бар ортаға көшіріледі. Алынған төзімді клеткалар геномында енгізілген бөтен ДНҚ фрагменттері болғандығы блот-гибридизация арқылы анықталды.

Баллистикалық әдіс – алтын немесе вольфрам микробөліктерінің (0,4-1,2 мкм) бетіне кальцийді, полиэтиленгликольді пайдаланып ДНҚ-ны қондырады,кейін сол микробөліктермен арнайы қондырғы арқылы өсімдік клеткаларын атқылайды. Металл бөліктері 300-600м/с жылдамдығымен клетка қабығын және мембраналарды тесіп өтеді. Реципиент ретінде әртүрлі ұлпалар қолданылады.

Липосомаларға қаптау. Экзогенді генетикалық материалды рестриктазалардың ыдырату әсерінен қорғау мақсатында липосомаларға қаптау әдісі қолданылады.

Липосомалар – фосфолипидтерден тұратын сфера тәрізді қабық. Фосфолипидтердің сулы эмульсиясын ультрадыбыспен өңдеу арқылы немесе сулы ерітінді мен липидтерді шайқау арқылы алады. Фосфатидилсерин мен холестериннен тұратын липосомаларды өсімдіктер мен жануарлар клеткаларына рекомбинантты ДНК-ны енгізу мақсатында қолданады. Гендерді липосомаларға қаптау арқылы тасымалдау әдісінің токсинділігі төмен.