Генді-инженериялық әдіспен құрастырылған бактериялардың жасушаларында түзілген адамның соматотропты препараты химиялық таза, вирустармен ластанбаған, көп мөлшерде алуға мүмкін.

32. Инсулин гормонының синтетикалық гендері. Адамның инсулин гормонын өндірістік деңгейде, гендік инженериялык жолмен синтездеу.

Инсулин  ұйқыбез аралшық бездің (островков Лангерганс) белоктық гормоны. Инсулин 51 амин қышқылы қалдығынан құралған глобулярлы белок, молекулалық салмағы  5700 дальтон, молекуласы екі дисульфидтік байланыспен байланысқан екі полипептидтік тізбектен (А және В тізбектерінен) турады. Организмде инсулин көмірсулардың алмасуын реттейді, клеткадағы белоктардың синтезін күшейтеді, липидтердің алмасуына әсер етеді, плазмалық жарғақша арқылы глюкоза өткізгіштігін ұлғайтады.

Инсулиннің негізгі нысана-мүшелері – бауыр, бұлшық ет және май ұлпа.

Өнеркәсіпте инсулинді алу

Инсулин препараттарды келесі әдістерді қолданып алу мүмкін: табиғи шикі заттардан бөліп алу; химиялық синтез немесе генді-инженериялық әдісті пайдаланып.

Инсулин молекуласының химиялық синтезі 170 реакция арқылы жүзеге асырылады, сондықтан бұл өте күрделі, қымбат өндіріс, өнеркәсіпте пайдаланылмайды.

Өнеркәсіпте инсулин алу әдістерін қарастырайық.

Табиғи шикізаттан бөліп алу. Ең бірінші инсулин препаратын 1921 ж. канадалық ғалымдар Ф.Бантинг мен П.Бест бұзау ұйқыбезінен бөліп алды. Жануарлар ұйқыбезінен алынған инсулин препаратын рынокқа Эли Лилли компаниясы 1923 жылы шығарды.

Өнеркәсіпте инсулинді алу үшін шикі зат ретінде жануарлар ұйқыбезін пайдаланады. Фармзауыттарда ұйқыбезінен экстракция арқылы инсулинді бөліп алады, сонан соң тазартады.

Ұлпаның экстракциясын жүзеге асырғанда ең тиімді және көп пайдаланатын экстрагент  су. Ұлпа сумен көп уақыт әрекеттеседі, сондықтан ортанын температурасы 30⁰ –тан жоғары болмау керек. Өнеркәсіптік жағдайда экстракт сұйылмау және гормон концентрациясы төмендемеу керек. Бұл мақсатты шешу үшін материалдың бір бөлігін бірнеше рет экстракцияға ұшыратады.

Ұсақ дисперсті клеткалық материал, жарым-жартылай бөлінген клеткалар мен клетка ішіндегі биополимерлер фильтрация немесе центрифугтау арқылы бөлініп кетіріледі. Фильтрацияны вакуумдық фильтрді - ленталық, барабандық немесе фильтр-пресс түрлерін қолданып жүзеге асырады. Сұйықтықты центрифугалау үшін ерекше сепараторларды пайдаланады

Гормон ерітінділерін буландыру, ультрафильтрация және басқа әдістердің көмегімен қоюландырады. Ерітінділерді бұландыру арқылы қойылтуы булау пленкалық аппараттарда жүзеге асырылады. Булау аппаратынан кейін тоңазытқыштарды орналастырады, себебі ерітіндінің температурасын өте тез төмендету қажет. Булау процесін вакуумдық жағдайда іске асырғанда ерітіндіні буландыруды 20⁰-та жүргізу мүмкін. Ультрафильтрация екі түрлі қызмет атқарады: ерітіндіні қойылтады және ерітіндіні төмен молекулалық қоспа заттардан тазартады. Инсулинмен бірге экстракция нәтижесінде суға қосымша заттар көшеді. Ультрафильтрация әдіс молекулалық салмағына байланысты заттарды бөледі. Инсулин органикалық еріткіштердің көмегімен шөгеді және ерігіштендірмеу іске асырылады. Келесі сатысында инсулин препаратын целлюлоза негізіне алынған иониттерді, ерекше өңделген крахмалды, сефадекстерді т.б. шайырларды пайдаланып, хроматография әдісінің көмегімен тазалайды. 800-1000 г ұйқыбезінен 100 г кристалдық инсулин алынады.

Дәрі ретінде пайдалану үшін тазалығы жеткілікті инсулин препаратын стандартайды, белсенділігін стандарт мағынасына жеткізеді. Стандарт мағынасы ГОСТ-пен белгіленеді. Сонан соң препараттарды тауарлық формалары түрінде дайындайды.

Жануарлар ұйқыбезінен бөлініп алынған инсулинмен адамдарды емдегенде оның қосымша зиянды әсері жағымсыз салдарға әкелуі мүмкін, мысалы кейбір адамдарда, әсіресе балаларда көздің, бүйректің қызметі бұзылады, аллергия дамиды. Сондықтан дәрі ретінде адам инсулинін ғана пайдалану керек, бірақ адамдардың ұйқыбезін шикі зат ретінде алу мүмкін емес. Сонымен бірге жануарлар ұйқыбезінен бөлініп алынған инсулин препараттары аурулардың барлығына жетпейтін болды.

Жануарлардың ұлпаларынан бөлініп алынған инсулинді адам инсулиніне айналдырудың бір жолы жүзеге асырылды.

Жануарлар мен адам инсулинінің айырмашлығы шамалы.

Әр түрлі организмнің инсулинін осы сипаттамаларды негізіне алып, адам инсулинін алу әдісі құрылды. Шошка ұйқыбезі инсулиннің В-тізбегінде 30-аминқышқылы  аланин, ал адам инсулинің В-тізбегінде  треонин.

Данияның "Ново индастри" компаниясы шошқа инсулинін адам инсулиніне аудару үшін ерекше әдісті жүзеге асырды. Химиялық реакциялар арқылы шошқа инсулинінің В-тізбегіндегі 30 аланин қалдығын треонин қалдығына ауыстырылды, яғни шошқа инсулині адам инсулиніне айналдырылды. Алынған препарат белсенді және адам инсулинімен салыстырып оның ұқсастығы көрсетілді.

Генді-инженериялық әдіс. Организмде инсулин препроинсулин түрінде түзіледі. Препроинсулин молекуласының құрамына N-соңында сигналдық пептид және екі полипептидтік тізбегін байланыстыратын С-пептид кіреді. Белсенді инсулин түзілу үшін, алдымен препроинсулиннің N-соңындағы сигналдық пептид бөлініп кетеді, түзілген проинсулин молекуласынан протеаза ферменттің қатысуымен шектелген протеолиздің нәтижесінде С-пептид бөлініп шығады да, екі полипептидтік тізбегі түзіледі: А және В тізбектері.

Белсенді инсулин молекуласында бұл тізбектер дисульфидтік байланыстар апқылы тіркескен. Инсулин қан құрамына түскенге дейін Лангерганс аралшықтың В-клеткаларында цинкпен байланысқан гексамер түрінде жиналады.

Генді-инженериялық әдісі арқылы инсулин алу үшін зерттеу жұмыстары 30 жылдан астам уақыт жүргізіледі. 1978 ж. АҚШ-ма егеуқұйрық инсулинін синтездейтін E. colі штамы құрылды. 1978 ж. адам инсулинінің екі полипептидтік тізбегі генді-инженериялық әдіс арқылы алынды. Алдымен адам инсулинінің А және В-тізбектерін кодтайтын гендерінің химиялық синтезі іске асырылды. Синтетикалық гендерді Е.соlі жасушаларына енгізеді де, олардың экспрессиясы нәтижесінде инсулиннің екі полипептидтік тізбегін алады. Содан кейін полипептидтік тізбектерді дисульфидтік байланыстармен байланыстырды.

Бұл жұмыстың барысы келесі:

Әр полипептидтік тізбегінің синтетикалық генінің 3'-соңғы жағына β-галактозидаза ферменті кодтайтын генді байланыстырады, сонан соң векторлық плазмиданың (рВR322) құрамына енгізеді, рекомбинантты плазмиданы құрады да, E.colі жасушаларға енгізеді. Трансформацияға ұшыраған E.colі жасушалар гибридті ақуыздарды синтездеу қабілеттілігін көрсетті. Экспрессия нәтижесінде түзілген гибридті (химерлі) ақуыз алынды. Химерлі ақуыздың молекуласында инсулиннің А немесе В полипептидтік тізбектері метионин қалдығы арқылы β-галактозидаза бөлігімен байланысқан. Химерлі ақуызды бромциан затының әсеріне ұшыратып метионин қалдығы қатысуымен түзілген пептидтік байланысын үзеді де, инсулин пептидті (А немесе В) бөліп алады. Сонан соң А мен В полипептидтерді дисульфидтік байланыс арқылы байланыстырады. Бұл әдістің қиыншылығы табиғи инсулинге тән дұрыс дисульфидтік байланыстардың түзілуіне, яғни ақырғы кезеңіне байланысты.

1980 ж. АҚШ-та У.Гилберт әріптестерімен адам ұлпаларынан инсулиннің мРНҚ-сын бөліп алды. мРНҚ-ның негізінде кери транскрипция әдісімен кДНҚ-ны құрды. кДНҚ-ны рВR322 плазмидаға енгізді, одан кейін адам проинсулинінің гені клондалды. кДНҚ-ның экспрессиясын жүзеге асырып, адам инсулинін алды. Инсулин  генді-инженериялық әдіс арқылы алынған ең бірінші медикалық препараты. 1983 ж. (Эли Лилли) америкалық компания генді-инженериялық инсулинді сату үшін шығарды. Коммерциялық атауы  (хемулин). "Эли Лилли" мен “General” компаниялары бірігіп, 40 млн доллар бөледі де, генді-инженериялық әдіс арқыл инсулин алу өндірісі үшін зауыт салады. 1990 жылға дейін АҚШ-та генді-инженериялық инсулин өндірісін қаржыландыру 235 млн долларға жетті.