3. Реттелгіш промоторлар: tac, lac, lp, t7. Олардың сипаттамасы.

Гендердің экспрессиясын оптимизациялау үшін:

1. Жақсы промотор қажет;

2. Өте мықты терминатор керек;

3. Рибосомамен байланысушы сайт RBS керек;

4. Дүниеге келген белоктың клеткада орналасуын білу қажет;

5. Синтезделген белоктың тұрақтылығы (яғни, өмір сүру ұзақтығы факторларға тұрақтылығы).

Ең маңыздысы!!! Клондалған генді промоторға қатысты дұрыс бағытта (орентацияда) орналастыру керек, себебі егер генді промоторға қатысты дұрыс емес бағытта орналастырса геннің оқылуы өзгереді де мүлдем дұрыс емес басқа белок синтезделеді.

Промоторлар – геннің РНК-полимераза ферменті танитын реттегіш ауданы. Промоторлардың екі түрі болады:

1. Конструктитивті гендердің үздіксіз экспрессиялануын қамтамасыз етеді;

2. Индуцебильді қоршаған орта факторларына тәуелді экспрессияланады. Мысалы: лактоза оперонының промоторы. Мұндай промоторларды реттелетін промоторлар деп те атайды. Гендік инженерияда гендердің экспрессиясын оптимизациялау мақсатында реттелетін промоторларды ғана пайдаланады.

Көп қолданылатын промоторлар:

1. Лактоза опейронының промоторы (lac-промотор) – реттелетін промотор. Ортаның құрамында лактозаның бар-жоғына тәуелді:

i-индуктор изопропилтиогалактозид репрессорды өзіне байланыстырып, оның оператор ауданымен байланысын тежейді. Соның нәтижесінде синтез жүреді.

R –тек бос күйінде ғана оператормен байланысады.

цАМФ + САР (catabolite activator protein) комплексі – РНК-полимеразаның промотормен туыстығын арттырады.

2. Триптофан опейронының промоторы (trp-промотор) – триптофан амин қышқылының синтезіне жауапты. Ортада триптофан амин қышқылының бар-жоғына тәуелді.

Егер ортаның құрамында триптофан амин қышқылы болмаса, онда синтез жүреді. Ал егер ортаның құрамында триптофан амин қышқылы болса, онда синтез жүрмейді. Бұл жерде триптофан корепрессор қызметін атқарады.

Репрессоры өзі өзі оператормен байланыса алмайды, оған coR керек. Оны триптофан атқарады. Егер триптофан болса тежейді. Сонда триптофан синтезі тоқтап қалады.

3. tac-промоторы – лактоза опейроны мен триптофан опейронының промоторларының гибриді.

tac-промоторының артықшылығы: екі түрлі индукторлармен реттеуге болады:

Біріншісі – изопропилтиогалактозид (ИПТГ), ал екіншісі – триптофан амин қышқылы.

4. PL- промотор – λ-бактериофагының промоторы. cI репрессорымен реттеледі. PL- промоторының . cI репрессорының гені компитентті клеткалардың геномында болады.

сІ-репрессор – 28-300С-та активті, яғни синтез жүрмейді. Оператормен байланысып, геннің экспрессиялануын тежейді. Ал егер температураны 40-420С болса, сІ-репрессор денатурацияға ұшырайды да, өзінің активтілігін жоғалтады. Сөйтіп, оператормен байланыса алмайды, соның нәтижесінде синтез жүреді.

5. Т4 бактериофагының 10-шы генінің промоторы

6. Т7 бактериофагының промоторы. Ең адал промотор, ол тек қана Т7 бактериофагының РНК-полимеразасымен ғана байланысады.

28. Ті плазмидасы. Ті плазмидасының мутанттары.

Агробактерия - топырақта мекендейтін бактериялардың тобы. Олар өсімдіктерге жұғып тәж тәрізді өсіндіні, яғни ісікті, бұлтықты пайда болғызады. Бұл бактерия өсімдіктік жарақат- танған ұлпасы арқылшы клеткаға кіргенде өзінң гендерін бірге ала келіп, өсімдік геномына енгізеді. Соның салдарынан өсімдікті жаңа белоктарды синтездеуге мәжбұр еткізеді. Нәтижесінде бактерия гендерін қабылдаған өсімдік клеткалары өте тез көбейіп, тамыр мойынында (тамыр мен сабақтын арасында) ісік, бұлтық пайда болады.

Бұл инфекция процесі шын мәнісінде табиги гендік инженерия. Ісікті қоздыратын агент осы бактерияның плазмидасы, оны Ті- плазмида деп атайды . Бұл плазмидалар сақина тәрізді массасы 1,2х10⁸ қД (агробактерия хромосомасының көлемінің 3-5%) ДНҚ молекулалары. Олар бактерия клеткаларында өз бетімен репликацияланып көбейеді.

Американ генетиктері 1977 жылы анықтағандай, тәж тәрізді ісіктер өсімдік хромосомасының құрамына Ті-плазмиданың белгілі бір бөлігінің кіруі арқасында пайда болады. Бұл фрагментті Т- ДНҚ деп атайды..

Ісік клеткаларында сау клеткаларда болмайтын опиндер деген жаңа классқа жататын химиялық заттар табылды. Опиндер - ол аргинин амин қышқылының туындылары. Жақсы зерттелгендер: октопин - аргинин мен пирожүзім органикалық қышқылының туындысы, нопалин - аргинин мен а-кетоглутараттың туындысы. Ауру туғызған бактерияның штаммына байланысты ісік клеткалары октопинді немесе нопалинді синтездейді

Ті-плазмидалар өздерінің құрамында жазылған опин түрі бойынша жіктеледі. Т-ДНҚ-ны өсімдік клеткасына тасымалдау және хросасомалық Т-ДНҚ құрамына кірістіру процесіне жауапты VIR-гендер плазмида бойында Т ДНҚ дан алшақ орналасады. Сол сияқты опиндерді ыдырататын гендер де Т ДНҚ дан алшағырақ орналасады.

Ті-плазмидада Т-ДНҚ екі ұшынан да бір-бірінен аумайтын, ұқсас ұзындығы 25 нуклеотидтердің жұбынан тұрады. Ол нуклеотид тізбектерінің, мүмкін, Т-ДНҚ-ны өсімдік клеткасына тасымал- дауына қатысы бар шығар. Ісіктің пайда болуына Ті-плазмида дәл өзі себепші екені (хромосомалық гендер емес), плазмидалары жоқ немесе мутанттық Ті-плазмидалары бар агробактерия штамм- дарын қолдану арқылы дәлелденді. Ті-плазмидалары жоқ агробак- териялар жұққан өсімдіктерде ісік пайда болмайды және де опин- дер синтезі өтпейді. Мутантармен өткізілген генетикалық зерттеулер көрсеткендей, Ті-плазмиданың Т-ДНҚ фрагменті гана ісіктің пайда болуына, опиндер синтезіне және дифференцияланудың тежелуіне жауапты.

Ісік тудыратын қабілеті төмен мутант - октопин түзгіш плазмида алынған. Оның бағалылығы, ол ісік ұлпасына жақын орналасқан нормалы клеткалардың аномальдік дифференцировкасын арттырады. Мысалы, тамыр мен өркеннің күшті өсуіне себепкер болады. Осы плазмидамен трансформацияланған темекі клеткалар популяциясында кейбір жеке клеткалар (өте сирек болса да) регенерант өсімдігін берген. Бұл өсімдіктердің барлық ұлпалары октопинді синтездеу қабілетін Т-ДНҚ-ның болуы нәтижесінде сақтаған. Осы трансформацияланған өсімдіктерді нормалы темекі өсімдігімен будандастырып, кейіннен сол буданнан алынған ұрықтарды өсірген. Сонда көрсетілгендей, октопин синтездеуге қабілеттілік (яғни Т-ДНҚ) Мендель заңдылығына сәйкес анальқ және аталық жағынан да тұқым қуалаған. Демек, Т-ДНҚ хромосомаға тіркескеннен кейін өсімдіктің әдеттегі гені болып сіңіп кетеді.

29. Ті-плазмидасы негізіндегі векторлар.

Ті-плазмиданы вектор ретінде пайдаланудың бір қиыншылығы, оның көлемінің үлкенділігі- 200-800 м.н.ж. Т-ДНҚ-ны өсімдік клеткасына тасымалдау және хромасомаға тіркестіру үшін онымен шекаралас жатқан нуклеотидтер тізбегінің және де оған қоса ісік тудыратын вируленттік (vir) бөлігінің қажет екендігі анықталған. Сондықтан, қазір бүтін Ті-плазмиданы толығымен емес, тек оның жоғарыда аталған vir бөлшегін ғана пайдаланады.

Бірінші әдіс- «екіаралық векторлар» әдісі- ішек таяқшасы бактериясының (E.coli) pBR322 -плазмидасын қолдануға негізделген. Рестриктазамен Т-ДНҚ Ті-плазмидадан кесіп алып, pBR322- плазмидаға тіркестіріледі, лигаза ферментімен тігіледі. Одан кейін сол Т-ДНҚ қосылған pBR322-плазмиданы E.coli клеткасына кіргізіп, бактериялардың көбеюіне жағдай жасайды. Содан соң көбейген плазмидаларды бактериялардан бөліп алады. Құрамында Т-ДНҚ бар клондалған бактерия плазмидасына көзделген мақсатқа сай бөтен құрылымдық генді орналастырады. Осы плазмидадан, Т-ДНҚ-дан және бөтен құрылымдық геннен құрастырылған рекомбинанттық ДНҚ-ны көбейту керек. Ол үшін оны E.coli клеткасына енгізіп бактерияларды өсіреді. Сол кезде рекомбинанттық ДНҚ да көбейеді. E.coli биомассасынан рекомбинанттық ДНҚ-сы бар плазмиданы, яғни екіаралық векторды көп мөлшерді бөліп алады.

Екінші әдіс- бинарлық векторлар жүйесін қалыптастыруға негізделген. A. tumefaciens арқылы өсімдіктерге ісік ауруларын жұқтырып, оларды трансформациялау үшін бүтін Ті-плазмида емес, оның екі бөлшегі ғана жеткілікті. Біріншісі- Т-ДНҚ-ның екі жағындағы тек шекаралық бөліктер, екіншісі- Ті-плазмиданың вируленттік (vir) бөлігі. Егер агробактериялардың бір плазмидасында vir бөлігі болса, ал екіншісінде Т-ДНҚ бөлігі болса, олар өсімдік клеткаларын трансформациялауға қабілетті. Сонымен Т-ДНҚ-ның құрамына қандай да бөтен ген ендірілсе, сол өсімдік геномына тіркесе алады. Бірақ солай болғанның өзінде де, Ті-плазмидалық векторлар арқылы өсімдікке енгізілген бөтен гендердің экспрессиясы өтпейді. Мысалы, темекі геномына Ті-плазмидалық векторлар көмегімен өз промоторларымен бірге енгізілген бактерия (антибиотикке қарсы ферменттер гендері), жануар мен өсімдік (леггемоглобин гені) гендерінің экспрессиясы жүрмеген.