22. Прокариот жүйесінде клондалған гендердің экспрессиясын оптимизациялау.

Гендердің экспрессиясы бірнеше деңгейде жүреді:

• Транскрипция деңгейінде;

• Постранскрипциялық модификация;

• Процессинг немесе сплайсинг;

• мРНК-ның ядродан босап шығуы;

• Трансляция (белок биосинтезі);

• Пострансляциялық модификация деңгейінде.

Гендердің экспрессиясын оптимизациялау үшін:

1. Жақсы промотор қажет;

2. Өте мықты терминатор керек;

3. Рибосомамен байланысушы сайт RBS керек;

4. Дүниеге келген белоктың клеткада орналасуын білу қажет;

5. Синтезделген белоктың тұрақтылығы (яғни, өмір сүру ұзақтығы факторларға тұрақтылығы).

Ең маңыздысы!!! Клондалған генді промоторға қатысты дұрыс бағытта (орентацияда) орналастыру керек, себебі егер генді промоторға қатысты дұрыс емес бағытта орналастырса геннің оқылуы өзгереді де мүлдем дұрыс емес басқа белок синтезделеді.

Промоторлар – геннің РНК-полимераза ферменті танитын реттегіш ауданы. Промоторлардың екі түрі болады:

1. Конструктитивті гендердің үздіксіз экспрессиялануын қамтамасыз етеді;

2. Индуцебильді қоршаған орта факторларына тәуелді экспрессияланады. Мысалы: лактоза оперонының промоторы. Мұндай промоторларды реттелетін промоторлар деп те атайды. Гендік инженерияда гендердің экспрессиясын оптимизациялау мақсатында реттелетін промоторларды ғана пайдаланады.

Көп қолданылатын промоторлар:

1. Лактоза опейронының промоторы (lac-промотор) – реттелетін промотор. Ортаның құрамында лактозаның бар-жоғына тәуелді:

i-индуктор изопропилтиогалактозид репрессорды өзіне байланыстырып, оның оператор ауданымен байланысын тежейді. Соның нәтижесінде синтез жүреді.

R –тек бос күйінде ғана оператормен байланысады.

цАМФ + САР (catabolite activator protein) комплексі – РНК-полимеразаның промотормен туыстығын арттырады.

2. Триптофан опейронының промоторы (trp-промотор) – триптофан амин қышқылының синтезіне жауапты. Ортада триптофан амин қышқылының бар-жоғына тәуелді.

Егер ортаның құрамында триптофан амин қышқылы болмаса, онда синтез жүреді. Ал егер ортаның құрамында триптофан амин қышқылы болса, онда синтез жүрмейді. Бұл жерде триптофан корепрессор қызметін атқарады.

Репрессоры өзі өзі оператормен байланыса алмайды, оған coR керек. Оны триптофан атқарады. Егер триптофан болса тежейді. Сонда триптофан синтезі тоқтап қалады.

3. tac-промоторы – лактоза опейроны мен триптофан опейронының промоторларының гибриді.

tac-промоторының артықшылығы: екі түрлі индукторлармен реттеуге болады:

Біріншісі – изопропилтиогалактозид (ИПТГ), ал екіншісі – триптофан амин қышқылы.

4. P_L- промотор – λ-бактериофагының промоторы. cI репрессорымен реттеледі. P_L- промоторының . cI репрессорының гені компитентті клеткалардың геномында болады.

сІ-репрессор – 28-30⁰С-та активті, яғни синтез жүрмейді. Оператормен байланысып, геннің экспрессиялануын тежейді. Ал егер температураны 40-42⁰С болса, сІ-репрессор денатурацияға ұшырайды да, өзінің активтілігін жоғалтады. Сөйтіп, оператормен байланыса алмайды, соның нәтижесінде синтез жүреді.