21. Трансгендердің экспрессиялануын айқындау. Иммуноблоттинг. Бірінші және екінші реттік антиденелер.

Скрининг

1.Қажет генді барлық бактериялар массасынан алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда бактерияның әрбір жеке клеткасы жеке ұрпақ береді яғни бактериялық шоғыр түзіледі.

Енді гендер жинағын яғни әр түрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл процесс скрининг деп аталады. Гендер жинағы аз болған сайын одан қажет генді табу оңай.

Комплементарлы ДНҚ клонын көбейту әдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы әдістер қолданылады. Кең тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады.

1. Шоғырларды гибридизациялау

Ол үшін Петри шынысындағы негативтік шоғырларға (рДНҚ-сы бар бактериялар) нитроцеллюлозалы сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар агарды бірнеше жерден инемен шаншиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен өңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, нитроцеллюлозамен байланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады.

Ген скринингісінің келесі жауапты кезеңі сүзгіні радиоактивті зондпен өңдеу.

Зонд (сүңгі) дегеніміз іздеп жатқан ген бөлігінің азоттық негіздеріне комплементарлы кішігірім ДНҚ немесе РНҚ тізбегі. Сүңгі әр уақытта радиоактивті изотоппен белгіленеді. Сүңгіні синтездеу үшін геннің немесе белоктың ең болмағанда кішігірім бөлігінің нуклеотидтер тізбегі белгілі болуы керек. Олардың амин қышқылдар тізбегі бойынша және генетикалық кодтың көмегімен геннің бөлігін кодтайтын нуклеотидтор тізбегін оңай алуға болады. Алайда, кодтың туылмалы (синонимділігін) екендігін ескеру қажет, сондықтан белоктың белгілі тізбегінен метионин және триптофан амин қышқылдары (олардың бірден ғана кодондары бар) болатын бөліктерінен синтетикалық олигонуклеотид — синтезделеді.

Табиғи сүңгі ретінде қажет геннің функциясы қарқынды өтетіні белгілі клеткадан әр түрлі жолдар арқылы алынған РНҚ-ны пайдалануға болады.

Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі. Сүңгі тек өзіне комплементарлы генмен ғана байланысады.Сондықтан сүңгі бір тізбекті болуы және гибридизация қолайлы жағдайда өтуі қажет: жоғары температура (бірақ тым көтеріңкі емес, өйткені түзілген гибридтер қайтадан ыдырап кетеді), ұзақ уақыт (сүңгі өзінің ДНҚ-сын тауып үлгіруі үшін). Гибридизация процедурасы аяқталғаннан кейін сүзгіні жуып артық сүңгілерден тазалайды, өйткені сүзгіге жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта түзеп, гибридизация нәтижесін бұзады. Енді қажет ген бар ДНҚ тізбегі сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе иод) түрінде таңбаланады. Оның орнын табу салыстырмалы қарапайым: сүзгіні кәдімгі рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспозициядан соң (оның уақыты радиактивтіліктің күшімен анықталады) фотопленканы шығарады. Сүзгідегі радиоактивті ДНҚ бар орын фотопленкада кішігірім қара дақ түрінде көрінеді. Осындай фотопленкада радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі арқылы табу әдісі -ауторадиография деп аталады. Сүзгідегі дақтың орнына қарай отырып, газоннан қажет рДНҚ енген негативтік шоғырды табуға болады.

Антиденелер— адам мен жануарлар организміне енген жат бөгде ірі молекулалы протеиндік заттарға (антигендерге) қарсы иммундық реакциялар нәтижесінде түзіліп, олардың зиянды әсерлерін жоятын протеиндік заттар (негізінен гамма-глобулиндер); адам және жылықанды жануарлар денесінде пайда болған антигендерге қарсы қан плазмасында түзілетін ақуыздық заттар. Антиденелер ағза иммунитетін күшейтуде маңызы үлкен. Антиденелерді лимфоциттер мен плазмоциттер бөледі. Антиденелерге тән қасиет — тек өздерінің түзілуіне әсер еткен антигендермен ғана әрекеттесіп, оларды жояды. Антиденелер — организмде қан сарысуы мен ұлпаларда жинақталады. Антиденелер антигендермен әрекеттесу сипатына қарай агглютининдер, гемолизиндер, бактериолизиндер, преципитиндер болып бірнеше топтарға бөлінеді

Бірінші реттік антиденелер(primary antibodies) - Иммунологиялық анализ барысында нысана молекуламен байланысатын антиденелер(мысалы Имунноферментативті анализ әдісімен).

Екінші реттік антиденелер–антиген-антидене біріншілік комплексін көру үшін(визуализация) қолданылады

Кез келген иммуногистохимиялық әдістің маңызды кезеңі «антиген-антидене» реакция нәтижелерін көру болып табылады. Антигендермен байланысқан антиденелерді әр түрлі антиденелердің Fc-фрагментімен байланысқан белгілерді пайдаланып анықтауға болады. Мысалы:

- флюорохромдар;

- ферменттер;

- металл және металлопротеидтер;

- радиоизотоптар;

- аралық байланыстырушы заттар, мысалы, биотин, дигоксин, дигоксигенин.

Берілген белгілер бірінші реттік антиденелермен қатар екінші реттік антиденелермен коньюгациялана алады. Егер белгі бірінші реттік антиденемен байланысқан болса, бұл әдіс «тура әдіс» деп аталады. Бұл бақылаудың (визуализация) ең қарапайым әдісі, бірақ сезімталдылығы өте төмен, себебі бір антигенге бір белгіден келеді.

Әдістің сезімталдығы «тура емес» әдісте артады: бұл әдісте белгірелді бірінші реттік антиденелер емес екінші реттік антиденелер тасымалдайды, оларға бірінші реттік антиденелер антиген болып табылады. Мысалы: егер бірінші реттік антиденелер тышқандардан алынса, екінші реттік антиденелер қояндікі болуы мүмкін, олар тышқанның иммуноглобулиндерінің Fc-фрагментіне сецификалық болып келеді.

Сонымен қатар реакцияға тағы бір кезең қосылады, бұл әдістің артықшылығы бар: екінші реттік антиденелер басқа жануардың Fc-фрагментіне қарсы алу жеңілірек, сонымен қатар оларға белгіні байланыстыру оңай. Біріншілік антиденелер артық жүк тасымалдамайды, яғни , ұлпаларға оңай әрі тез өтеді, белгі антидене-антиген ара қатынасынан кейінгі конформациялық өзгерістеріне әсер етпейді.

Иммуноблоттинг (вестернблоттинг) – Иммуноферментативті анализге негізделген (ИФА) белоктарды анықтаудың сезімталдылығы жоғары әдісі. Бұл әдіс белоктық антигендерді зерттеу әдісі. Белоктарды электрофорез көмегімен бөледі де мембранаға тасымалдайды. Одан кейін мембрананы антедене ерітіндісінде инкубациялайды, байланысқан антиденелерді радиоизотопты және иммуноферментативті анализ арқылы анықтайды.