Одержання чистих культур мікроорганізмів

У природі мікроорганізми зустрічаються завжди у вигляді суміші різних видів. Для вивчення окремих видів мікроорганізмів необхідно мати так звані чисті культури цих мікроорганізмів.

Чисті культури також широко використовують під час приготу­ван­ня різноманітних товарів. Так, наприклад, для приготування заквас­ки при виробництві простокваші використовують чисту куль­туру молочних стрептококів (Str.lactis), для приготування закваски для виробництва ацидофільного молока використовують чисту культуру ацидофільної палички (Bact. аcidoph.), для виробництва вина, спирту, пива використовують чисті культури відповідних рас дріжджів, для виробництва лимонної кислоти використовують чисту культуру гриба Asperg. niger і т.д.

Під чистою культурою мають на увазі накопичення клітин одного і того ж виду мікроорганізмів, що утворюються з однієї клітини в результаті її розмноження. Для того, щоб одержати чисту культуру, необхідно, по-перше, ізолювати окрему мікробну клітину і тільки потім, створивши сприятливі умови для її розмноження, отримати з неї чисту культуру даного виду мікробів.

Існує кілька способів ізолювання окремих мікробних клітин. Найпростіший засіб, що набув широкого розповсюдження – виве­дення чистих культур методом висіву на тверді поживні середовища.

Цей метод зводиться до наступного: при розмішуванні розведеного висівного матеріалу в розплавленому твер­дому середовищі мікробні клітини розподіляються більш-менш дале­ко одна від одної. Далі, при застиганні поживного середовища, окремі клітини закріплюються у ньому у визначеному місці. Кожна ізольо­вана таким чином клітина розмножується на тому місці, куди потрапила, утворюючи накопичення клітин одного виду. Таке скупчення клітин називається колонією. Колонії видно неозброєним оком. Кожна колонія, яка утворилася з однієї клітини, є чистою культурою, яку необхідно ізолювати в окрему пробірку з поживним середовищем.

Чиста культура не має ніяких сторонніх добавок. Для того, щоб виростити чисту культуру і в подальшому процесі роботи не забруд­нювати її, необхідно, щоб поживне середовище, весь посуд і прилади, якими користуються для виділення чистої культури, були стерильними.

Техніка роботи при виділенні чистих культур згаданим мето- дом така:

• три пробірки з МПА (по 10–12 мл агару у кожній) нагрівають на киплячій водяній бані до розплавлення агару.

• три стерильних чашки Петрі розвертають з паперу і тушшю або спеціальним олівцем нумерують (№1, №2, №3). Крім того, на кожній чашці вказують висівний матеріал (тобто з чого зроблений висів), дату висіву і ким він зроблений.

Розплавлений агар переносять з кожної пробірки в окрему чашку Петрі, дотримуючись при цьому всіх правил стерильності. Корок пробірки обпалюють над полум’ям пальника, потім, витяг­нувши його, обпалюють край пробірки і, злегка відкривши чашку, виливають до неї поживне середовище з пробірки, після чого кришку чашки швидко закривають. У процесі роботи не можна торкатися ні пальцями, ні пробіркою нижньої або верхньої грані чашки.

Потім пропаленою петлею беруть трішки (одну крапельку) висівного матеріалу (висівним матеріалом може бути вода або інший рідкий продукт, а також настої різних продуктів, бактеріальні суспензії, що містять суміш різноманітних мікробів).

Злегка піднявши кришку чашки №1, змивають висівний матеріал з петлі у розплавлене поживне середовище. Чашку №1 зразу ж закривають і обмиту вже петлю змивають повторно у поживне середовище чашки №2, а потім цю ж петлю – у чашку №3. Таким чином, отримують три послідовних розведення висівного матеріалу. У чашку №1 могло потрапити дуже багато мікробних клітин, у чашці №2 їх буде значно менше, а в чашку №3 потрапить зовсім незначна їх кількість. Потім, злегка похитуючи чашки, ретельно перемішують поживне середовище, щоб внесені мікроорганізми рівномірно в ній розподілились. Температура поживного середовища при внесенні в нього висівного матеріалу повинна бути не вищою за 45°С (при більш високій температурі можуть загинути вегетативні клітини мікробів). Всі операції щодо перенесення поживних середовищ у чашки, внесення висівного матеріалу і перемішування його мають бути проведені швидко (щоб не застиг агар).

Перемішавши вміст, чашки залишають на столі до застигання агару (5–7 хвилин), а потім перевертають догори дном і вміщують у термостат для вирощування мікробів. Термостат – це шафа, в якій підтримується постійна, оптимальна для розвитку мікробів температура (для більшості мікробів у проміжку 32–36°С).

Через 2–3 дні у тих місцях, де закріпились клітини, в момент застигання поживного середовища утворюються видимі неозброєним оком колонії. Кількість колоній буде зменшуватись від чашки №1 до чашки №3. У чашці №3 колоній буде небагато і вони будуть розміщені ізольовано одна від одної. Для того, щоб впевнитись у тому, що дана колонія є чистою культурою, що утворилася з однієї клітини, необхідно взяти частину бактеріального нальоту з цієї колонії і виготовити препарат. Якщо при перегляді препарату під мікроскопом всі клітини виявляються однаковими за своїми морфологічними ознаками, то можна вважати, що дана колонія є чистою культурою.

Виділену і перевірену чисту культуру необхідно ізолювати в пробірку на скошений агар.

Для цього пробірку з розплавленим МПА (5–6 мл МПА у пробірці) кладуть у нахиленому положенні і залишають до застигання агару. Потім пробірку беруть у ліву руку, обхопивши її вказівним і переднім пальцями. Далі петлю обпалюють і охолоджують, торка­ючись поживного середовища біля тієї колонії, яку будуть ізолювати, тобто колонії, перевіреної на однорідність клітин. На охолоджену петлю наносять небагато бактеріального нальоту з цієї колонії, обпалюють корок пробірки, виймають і затискують її між мізинцем і долонею правої руки. Обпалюють край пробірки і вводять петлю з бактеріальним нальотом всередину пробірки. Потім про­водять петлею зигзагоподібну лінію по поверхні скошеного МПА, виймають петлю з пробірки, обпалюють внутрішній кінець ватного корку і закривають пробірку. Таким чином, здійснивши висів чистої культури з колонії на чашці Петрі у пробірку зі скошеним МПА, проводиться ізолювання чистої культури. Щоб запобігти забрудненню чистої культури, потраплянню в неї мікробів з повітря, що безперервно осідають на вільні поверхні у вигляді "мікробного дощу", висів необхідно проводити швидко, близько біля вогню: тримати пробірку в горизонтальному стані. Корок потрібно тримати так, щоб та частина, яка знаходиться всередині пробірки, була повернена вниз і не торкалась руки.

Пробірки з висівами вміщують на 2–3 дні в термостат. За цей час в результаті розмноження бактерій поверхня скошеного агару покривається нальотом чистої культури бактерій.