3.2. Экзоцитоз: кальций-зависимый и кальций-независимый.

Большинство клеток высвобождают макромолекулы во внешнюю среду путем экзоцитоза. Этот процесс играет роль и в обновлении мембраны, когда ее компоненты, синтезированные в аппарате Гольджи, доставляются в составе везикул к плазматической мембране (рис. 24).

Рис. 24. Сравнение механизмов эндоцитоза и экзоцитоза.

Между экзо- и эндоцтозом кроме разницы в направлении передвижения веществ, существует еще одно значительное различие: при экзоцитозе происходит слияние двух внутренних находящихся со стороны цитоплазмы монослоев, тогда как при эндоциозе сливаются внешние монослои.

Вещества, высвобождаемые путем экзоцитоза, можно разделить на три категории:

1) вещества, связывающиеся с клеточной поверхностью и становящиеся периферическими белками, например антигены;

2) вещества, включающиеся во внеклеточный матрикс, например коллаген и глюкозаминогликаны;

3) вещества, выходящие во внеклеточную среду и служащие сигнальными молекулами для других клеток.

У эукариот различают два типа экзоцитоза:

1. Кальций-независимый конститутивный экзоцитоз встречается практически во всех эукариотических клетках. Это необходимый процесс для построения внеклеточного матрикса и доставки белков на внешнюю клеточную мембрану. При этом секреторные везикулы доставляются к поверхности клетки и сливаются с наружной мембраной по мере их образования.

2. Кальций-зависимый неконститутивный экзоцитоз встречается, например, в химических синапсах или клетках, вырабатывающих макромолекулярные гормоны. Этот экзоцитоз служит, например, для выделения нейромедиаторов. При этом типе экзоцитоза секреторные пузырьки накапливаются в клетке, а процесс их высвобождения запускается по определённому сигналу, опосредованному быстрым повышением концентрации ионов кальция в цитозоле клетки. В пресинаптических мембранах процесс осуществляется специальным кальций-зависимым белковым комплексом SNARE.

3.3. Белковый комплекс snare.

SNARE – большая группа белков, осуществляющих слияние внутриклеточных транспортных везикул с клеточной мембраной (экзоцитоз) или органеллой-мишенью, такой как лизосома. Насчитывается около 60 белков SNARE.

Белки группы делятся на две функциональные категории:

• везикулярные белки (v-SNARE)

• белки принимающей органеллы (t-SNARE).

Наиболее изучены белки, которые выполняют доставку синаптических везикул к пресинаптической мембране и их слияние. Эти белки являются мишенями опасных бактериальных токсинов ботулизма и столбняка.

Белки SNARE являются небольшими, но широко-представленными мембранными белками. Несмотря на большую разницу в структуре и размере эти белки объединяет наличие одного и того же цитозольного домена из 60-70 аминокислот, называемого SNARE motif (или SNARE домен), способного к образованию обратимой, но прочной четырёхспиральной сцепки.

Такой транс-SNARE комплекс включает:

• синтаксин 1 – молекула синапсина состоит из трёх доменов: N-концевой регуляторный домен, комплексообразующий SNARE домен и C-концевой трансмембранный домен. Связывание синтаксина с синаптотагмином является кальций-зависимым.

• SNAP-25, находящиеся на клеточной мембране – мембранный белок, компонент белкового комплекса SNARE, осуществляющего стыковку синаптической везикулы с пресинаптической мембраной нейрона и их слияние с последующим высвобождением нейромедиатора. SNAP-25 является небольшим белком (около 25 кДа). Он крепится к мембране синаптической везикулы за счёт ацильных остатков пальмитиновой кислоты, находящихся в середине молекулы белка. При образовании стыковочного SNARE комплекса с синтаксином и синаптобревином SNAP-25 представляет две из четырёх α-спиралей комплекса. Ботулиновый токсин типа A, C и E приводят к расщеплению SNAP25, что вызывает паралич,

• синаптобревин на поверхности доставляемой пресинаптической везикулы – небольшой трансмембранный белок секреторных везикул; компонент белкового комплекса SNARE, осуществляющего конечные стадии экзоцитоза нейромедиаторов в синапс. Существует 2 изотипа синаптобревина (синаптобревин 1 и 2), синтезирующиеся в мозге. Молекулярная масса белка 18 кДа. По функциональной классификации синаптобревин относится к везикулярным белкам SNARE.

Синаптобревин вместе с синтаксином и белком SNAP-25 формирует SNARE комплекс, состоящий из 4 α-спиралей:

• одна принадлежит синаптобревину,

• одна – синтаксину

• 2 спирали – SNAP-25

Этот комплекс осуществляет кальций-регулируемый выброс нейромедиатора в синапс. Функция синаптобревина регулируется другими белками клетки.

Различают следующие этапы экзоцитоза:

Транспортировка везикулы от места синтеза и формирования (аппарат Гольджи) до места доставки осуществяется моторными белками вдоль актиновых филаментов либо микротрубочек цитоскелета. Этот этап может потребовать перемещения секретируемого материала на значительное расстояние, как, например, в нейроне. Когда везикула достигает места секреции, она входит в контакт со специфическими удерживающими факторами клеточной мембраны.

Удержание доставленной везикулы обеспечивается относительно слабыми связями на расстоянии более 25 нм и может служить, например, для концентрирования синаптических везикул около пресинаптической мембраны.

Стыковка везикулы с мембраной является непосредственным продолжением первой фазы доставки, когда мембрана везикулы входит в близкий контакт с мембраной клетки (5-10 нм). Это включает прочное соединение белковых компонентов обеих мембран, вызванным внутримолекулярными перестановками, и предваряет формирования SNARE комплекса.

Стимуляция (прайминг) везикулы фактически соответствует образованию особого SNARE комплекса между двумя мембранами и осуществляется только в случае нейронального экзоцитоза. Этот этап включает процессы молекулярных перестановок и АТФ-зависимые модификации белков и липидов, происходящие непосредственно до слияния мембран в ответ на подъём уровня свободного кальция. Этот кальций-зависимый процесс необходим для контролируемого быстрого выброса нейромедиатора и отсутствует в случае конститутивного экзоцитоза.

Слияние мембраны везикулы с мембраной клетки приводит к высвобождению, или выбросу, содержания секретируемой везикулы во внеклеточное пространство и объединению липидного бислоя везикулы с внешней мембраной. В случае синаптического выброса процесс слияния, так же как и стимуляция, осуществляется SNARE комплексом.