13.1. Метод окраски аурамином оо и родамином с

Для окраски препаратов флуорохромными красителями необходимы следующие реактивы:

-спирт этиловый 96°марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

-кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

-метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

-аурамин ОО (аурамин О-Sigma);

-родамин С, ТУ – 6-09-2463-77 (родамин В-«Sigma»);

-вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Раствор аурамина – родамина:

Аурамин ОО – 1,0г

Родамин С – 0,1г

Вода дистиллированная 1000мл.

Каждый краситель растворяют отдельно в 150-200мл дистиллированной воды и помещают в термостат при 37°С на 18-24 часа. Затем растворы сливают в одну емкость и доводят общий объем до 1000мл. Приготовленный раствор красителей хранят в емкости из темного стекла в прохладном, защищенном от света месте.

Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует допускать попадания на кожу его порошка или раствора.

Раствор 2. Обесцвечивающий раствор:

Концентрированная соляная кислота - 3мл;

Этиловый спирт 96° - 97мл.

Аккуратно добавить 3мл концентрированной соляной кислоты к 97 мл этилового спирта. Следует осторожно влить кислоту в спирт, но не наоборот.

Раствор 3. Гаситель фона.

Метиленовый синий хлорид – 25мг;

Вода дистиллированная 100мл.

В 100мл дистиллированной воды растворить 25мг метиленового синего хлорида.

На этикетке следует обозначить название раствора, концентрацию, дату приготовления и срок годности.

Растворы желательно хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев. При появлении в растворах преципитатов растворы перед использованием можно профильтровать.

Процедура окраски:

• стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальном штативе “рельсах” для окраски так, чтобы они не касались друг друга;

• мазки заливают раствором 1 на 1 час;

При окраске флуорохромными красителями ни в коем случае нельзя подогревать мазки и пользоваться полосками фильтровальной бумаги.

• тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой;

Промывание мазков в процессе окраски следует производить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменить флюоресценцию.

• обесцвечивают мазки раствором 2 в течение 3 минут;

• промывают дистиллированной водой;

• гашение фона осуществляют раствором 3 в течении 1 минуты.

Если препарат имеет интенсивную синюю окраску, можно очень аккуратно повторно промыть его дистиллированной водой;

• мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

Микроскопию производят по возможности сразу же после окончания процедуры окраски и высыхания мазков. В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранить, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции.

При окраске мазков необходимо:

• избегать неполного обесцвечивания, т.к. кислотоустойчивые микобактерии практически не обесцвечиваются;

• избегать приготовления толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.

Окрашенные флуоресцентными красителями мазки чувствительны к ультрафиолетовому свету, особенно во время процесса микроскопии и способны за несколько секунд обесцветиться. Для исключения этого мазки просматривают достаточно быстро, а при необходимости нужно сделать паузу, перекрыв поток света от лампы шторкой. Обесцветившиеся мазки можно повторно окрасить, однако это не всегда ведет к полному восстановлению окраски.