Реакции транскрипционно опосредованной амплификации (nasba, tas, 3sr)

Принципы всех этих изотермических реакций амплификации схожи и могут быть ограничены рассмотрением широко применяемой в настоящее время технологии - NASBA. Первые сообщения об этом методе были сделаны группой авторов Kwoh et al. в 1989г. В ходе реакции транскрипционно опосредованной амплификации происходит увеличение количества РНК, транскрибируемой со специального промотора (используется промотор для Т7-полимеразы), входящего в состав специфического праймера, который отжигается в определенном месте РНК- (и или ДНК) мишени. Если в случае первичной мишени используется РНК-матрица, то первые стадии процесса формируют полноценную структуру промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 для инициирования транскрипции. Для достраивания второй цепи ДНК после первого этапа- обратной транскрипции (стадия 2) также используется фермент РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза) (стадии 4-6), обладающая также и активностью РНКазы Н. Эта активность удаляет матричную РНК после синтеза первой цепи ДНК (2) и, следовательно, делает процесс "денатурации" ДНК-РНК гибрида (за счет гидролиза РНК) автоматически воспроизводимым в каждом последующем цикле амплификации. Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза транскрибирует за один цикл, время которого составляет 5-15 мин., 10⁵копий фрагментов РНК (7). Таким образом в течение 40-50 мин изотермической транскрипционно опосредованной амплификации ДНК или РНК в растворе образуется 10⁸-10⁹ копий. В настоящее время принцип NASBA используется в диагностических наборах, производимых фирмой Organon Technika.

Днк/рнк гибридный захват ( hibrid capture)

Принцип этого метода основан на иммунохимической детекции продуктов гибридизации нуклеиновых кислот РНК/ДНК или ДНК/РНК моноклональными антителами, узнающими образующиеся дуплексы. Если происходит детекция бактерий или ДНК-содержащих вирусов, то используется рибоолигонуклеотидный зонд. В случае когда выявлению подвергаются инфекционные агенты, содержащие рибонуклеиновые кислоты, такие, например, как вирус гепатита С используют дезоксирибонуклеиновый зонд. В современных наборах реагентов применяется хемилюминесценция, в качестве процесса, обеспечивающего чувствительную детекцию результатов гибридизации. Преимущество этого подхода заключается в том, что практически сведены к минимуму подготовка клинического материала и очистки нуклеиновых кислот, что позволяет использовать иммунохимическую детекцию специфического РНК/ДНК гибрида для скрининга.

Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов (bDNA)

Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов представляет собой пример амплификационных технологий, позволяющих усиливать в ходе определения сигнал. В результате многоступенчатого процесса гибридизации происходит присоединение многочисленных зондов, коньюгированных с молекулами фермента, окисляющего специальный субстрат и запускающий таким образом хемилюминесценцию.

Приложение № 5 Предимплантационная генетическая диагностика (пгд)

Только благодаря появлению метода FISH-анализа стало возможным проведение ПГД, позволяющей выполнить генетическое тестирование эмбриона еще до переноса его в полость матки и наступления беременности. Впервые ПГД провели в 1988 г. в Лондоне, в госпитале «Хаммерсмит». С тех пор в рамках программы ЭКО уже проведено несколько тысяч таких процедур, наступили и уже благополучно закончились сотни беременностей. В большинстве случаев биопсия эмбриона с целью ПГД проводится на так называемой стадии дробления Обычно на третьи сутки жизни в лабораторных условиях от нескольких эмбрионов – 7-10 (это зависит от результатов стимуляции овуляции у женщин) микроманипулятором берут один из 6-8 бластомеров. Немедленно, в течение нескольких часов, проводят FISH-диагностику на заинтересованные, согласно анамнезу супружеской пары, хромосомы или диагностику ДНК одной клетки с помощью модификаций ПЦР-метода. После этого в полость матки переносят только 2-3 генетически «здоровых» эмбриона. Очень важно отметить, что биопсия эмбриона проводится на том этапе развития, когда все его клетки-бластомеры недифференцированны, тотипотентны (totypotency – способность клеток дифференцироваться в любую из клеток взрослого организма), и поэтому возможно безопасное замещение удаленной клетки при дальнейшем дроблении оставшихся клеток. Безопасность этого метода для эмбрионов и соответственно младенца, родившегося из этого эмбриона, давно доказана. Установлено также, что биопсия эмбриона никак не повышает вероятности пороков развития человека, родившегося из этого эмбриона. Выявление генетического заболевания у плода методами инвазивной пренатальной диагностики предполагает необходимость прерывания беременности; доимплантационная диагностика преследует цель наступления беременности изначально здоровым плодом. Степень риска беременности больным плодом определяется в каждом конкретном случае при медико-генетическом консультировании. Проведение ПГД показано: 1. Носителям и больным хромосомными или генными заболеваниями с целью уменьшения риска рождения ребенка с генетической патологией: • пациентам с мозаичными вариантами синдромов Клайнфельтера, Тернера и др.; • носителям Робертсоновских транслокаций, маркерных хромосом, сбалансированных и др. перестроек в кариотипе; • лицам с моногенными заболеваниями или носителям этих заболеваний (муковисцидоза, гемофилии, болезни Гентингтона, мышечной дистрофии Дюшена и др.). 2. Для увеличения эффективности программы ЭКО с помощью «отсева» эмбрионов с числовыми аномалиями в кариотипе, которые выявляются более чем у половины рутинно переносимых эмбрионов: • женщинам в возрасте старше 35 лет; • лицам с плохим прогнозом ЭКО (три и более спонтанных прерываний беременности на ранних сроках); • пациентам с тремя и более неудачными попытками IVF/ICSI; • мужчинам с тяжелыми нарушениями сперматогенеза. Кроме того, с помощью метода ПГД стало возможным: • выявление «эмбрионов-носителей» болезней с поздней манифестацией и генетической предрасположенностью к тяжелым заболеваниям (онкология, болезнь Альцгеймера и т.д.); • проведение HLA (human leukocyte antigen) – типирование эмбрионов для подбора донора, идентичного по лейкоцитарному антигену больному ребенку – брату/сестре; • определение пола эмбриона для предотвращения передачи заболевания, сцепленного с полом.

21