Основные теоретические вопросы темы.
Введение. Понятие мутации. Структура ДНК. Классификация мутаций.
Общая характеристика методов ДНК-диагностики. Метод блотгибридизации по Саузерну, секвенирование (по Сэнджеру), метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Современные методы идентификации мутации: метод ДНК-чипов.
Прямые методы ДНК-диагностики. Их преимущества. SSCP –анализ. Метод денатурирующего градиентного электрофореза –DGGE. Метод ферментативного или химического расщепления некомплементарных сайтов –CMC. Гетеродуплексный анализ.
Непрямые методы ДНК-диагностики. Преимущества и возможности. Применение ПДРФ- анализа на примере диагностики наследственного заболевания.
Решите несколько заданий-моделей, используя диагностические и лечебные алгоритмы:
А. Геномная библиотека представлена:
1. учебным руководством по генетике
2. набором ДНК-зондов в составе рекомбинантных молекул
3. набором олигопраймеров к фланкирующим участкам гена
4. ДНК-зондами к сайтам рестрикции
5. коллекцией клонов известных хромосом
6. ДНК-содержащими вирусами
Б. Этапы полимеразной цепной реакции:
1. Получение и очистка ДНК
2. Амплификация ДНК (увеличение количества)
3. Денатурация нагреванием (разделение на 2 цепочки)
4. Добавление в раствор ДНК-полимеразы
5. Отжиг (добавление искусственных специфических олигопраймеров)
В. Этапы геномной дактилоскопии:
1. Обработка ДНК специфическими рестриктазами
2. Электрофорез
3. Получение ДНК (напр. из биологических жидкостей)
4. Гибридизация с искусственными ДНК-зондами (радиоактивными маркерами)
5. Блоттинг (получение отпечатков на нитроцеллюлезном фильтре)
6. Анализ вариабельных полос (участков ДНК); расчет % совпадений
Г. Выберите оптимальный метод молекулярной диагностики, позволяющий выполнить генетическое тестирование эмбриона еще до переноса его в полость матки и наступления беременности:
ПДРФ –метод
Метод предимплантационной диагностики с использованием FISH-анализа
Количественная ПЦР
Реакция гибридизации in situ
Д. На приеме у врача-невропатолога у мальчика 7 лет клинически диагностирована миопатия Дюшенна. Какими должны быть дальнейшие действия врача? Кто из родственников должен быть обследован и с помощью каких методов?
Граф логичной структуры темы «Современные методы ДНК-диагностики»
Виды ПЦР
Виды днк- диагностики
подтверждающая
носительства
пренатальная
пресимпто-матическая
предимплантационная
Приложение.
Приложение №1
Прямые и косвенные методы днк-диагностики.
Прямые методы основаны на поиске мутаций, приводящих к заболеванию. Как правило, они являются точными, могут быть использованы для подтверждения клинического диагноза и, в ряде случаев, для прогноза течения заболевания. Немаловажно также, что они могут быть информативны в семьях без пробанда, поскольку анализ мутаций возможен у родителей больного ребенка.
Недостатком данного подхода является сложность поиска патологических мутаций, особенно в больших (многоэкзонных) генах. В ряде случаев сложно определить, является ли обнаруженное изменение в структуре гена патологическим, и, таким образом, является ли оно причиной заболевания.
Косвенные методы основаны на анализе тесно сцепленных с патологическим геном полиморфных маркеров. Анализ наследования аллелей этих полиморфных маркеров и заболевания в семье позволяет определить, с какими аллелями в данной родословной сцеплен поврежденный ген, и, следовательно, проследить его наследование в данной семье по сцепленным с ним маркерным аллелям. Определенными условиями для проведения непрямой (косвенной) ДНК-диагностики являются уверенность в клиническом диагнозе, отсутствие генетической гетерогенности и доступность необходимых членов семьи - как правило, для исследования требуется генетический материал пробанда.
Обычный подход - по возможности использовать прямые методы ДНК-диагностики, а к косвенным методам прибегают либо как к дополнительным, либо в случае невозможности обнаружить мутации в исследуемой семье.
Для ДНК-диагностики в постнатальном периоде (у больных) обычно используются ядросодержащие клетки крови; для дородовой диагностики чаще всего используются клетки ворсин хориона, амниотической жидкости, кровь плода.
В любом случае необходимым условием проведения ДНК-диагностики является знание гена, ответственного за заболевание, или его примерного расположения относительно известных ДНК-маркеров (картирование гена). В настоящее время известны гены для подавляющего большинства распространенных тяжелых наследственных болезней, известны также гены для многих менее распространенных и редких заболеваний. Кроме того, гены, ответственные за большое количество наследственных заболеваний, картированы. Группа таких заболеваний, гены которых локализованы, но пока не идентифицированы, является наиболее динамичной: с одной стороны, идут интенсивные исследования, направленные на идентификацию картированных генов, а с другой - осуществляется картирование новых наследственных заболеваний. Всего в каталоге наследственных заболеваний Мак-Кьюсика (один из адресов электронной версии каталога в Интернете - http://www3.ncbi. nlm.nih.gov/Оmim/), включающем описания наследственных болезней, заболеваний с наследственной предрасположенностью и записи о генах, мутации в которых приводят к таким болезням, более 10 300 записей. В настоящее время трудно даже оценить, для какого количества наследственных болезней может быть проведена или уже проводится ДНК-диагностика. По-видимому, таких заболеваний более 1000.
Прямые методы ДНК- диагностики - это большая и разнообразная группа методов исследования молекулярной структуры ДНК, основные дифференциально-диагностические тесты, необходимость разработки которых обусловлена генетической природой наследственных заболеваний, их выраженным клиническим полиморфизмом, а также существованием генокопий и фенокопий. Особое место в этой группе занимают методы ДНК-диагностики (зондовой). Они позволяют диагностировать заболевание на уровне первичного молекулярного дефекта - патологического гена. Ее точность в установлении причины наследственного дефекта абсолютна. Среди основных методов ДНК-диагностики выделяются: - дозовый блот-гибридизационный анализ; - анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ); - полимеразная цепная реакция (ПЦР); - анализ полиморфизма микросателлитных последовательностей. Благодаря этим методам у врачей появились уникальные возможности эффективного применения в различных областях медицины самых совершенных технологий. В настоящее время в ДНК-диагностике выделяют 4 подхода. Они применяются в зависимости от того: известен или не известен ген данного заболевания (1), клонирован или нет этот ген или ДНК-копия его тРНК или кодирующей ДНК (2), известна или нет природа мутации, вызывающей заболевание (3), насколько широко распространена данная мутация в различных случаях данного заболевания в данной популяции, данном географическом регионе (4). Виды ДНК-диагностики: подтверждающая, пресимптоматическая, носительства, пренатальная. Прямые методы возможны лишь при условии, что ген заболевания клонирован, известна его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательностьполноразмерной комплементарной ДНК. При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена. Главным преимуществом прямых методов диагностики является почти 100% эффективность. Прямые методы основаны на технологии ПЦР. Однако в большинстве случаев наследственных заболеваний ген не клонирован или заболевание является генетически гетерогенным, т.е. обусловлено повреждением в разных генах, либо молекулярная организация гена не позволяет использовать прямые гены. Эти трудности могут быть преодолены с помощью косвенных методов ДНК-диагностики, основанных на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров. В этом случае определяется гаплотип хромосомы, несущей мутантный ген в семьях высокого риска, т.е. у родителей больного и его ближайших родственников. Такой подход возможен практически для всех моногенных заболеваний с известной локализацией гена. Основной недостаток косвенных методов диагностики - обязательное предварительное изучение генотипа (гаплотипа) хотя бы одного пораженного родственника. В случае отсутствия пораженных родственников, «доступных» для обследования, проведение диагностики (за редким исключением) становится невозможным.
Приложение №2.