Работа 5. Изучение влияние температуры и рН среды на активность трипсина

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, две водяные бани, 1 мМ растворы БАПНА в 0,05 М фосфатном буфере со следующими значениями рН: 9, 7.6, 6, 5, раствор трипсина (10 мкг/мл), 1 н HCl.

1. Для изучения влияния рН среды на активность трипсина пользуются растворами бапна с разными значениями рН, по 2 опыта и 2 контроля в каждой параллели. Активность определяют по схеме.

опыт	контроль
1,6 мл раствора БАПНА	1,6 мл раствора БАПНА
–	0,7 мл 1 н HCl
Преинкубация в термостате при 37 °С в течении 10 минут
0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл)	0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл)
Инкубация в термостате при 37 °С в течении 30 минут
0,7 мл 1 н HCl	–

Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Строят график зависимости активности трипсина от рН среды.

2. Для изучения влияния температуры среды на активность трипсина пользуются этой же схемой, используя раствор БАПНА со значением рН=7,6, но пробирки инкубируют:

а) при комнатной температуре;

б) при 4 °С (Инкубировать в холодильнике. Использовать предварительно охлажденные растворы!);

в) на водяной бане при t=55 °С;

г) на водяной бане при t=75 °С.

Содержание отчета

1. График зависимости активности трипсина от рН среды.

2. График зависимости активности трипсина от температуры.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ И АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода. Процесс трансаминирования вклю­чает межмолекулярный перенос аминогруппы с донорной а-аминокислоты на акцептор а-кетокислоту без промежу­точного образования аммония. Высокое содержание трансаминаз отмечается в тканях печени, сердца, мышц, почек животных. Реакции трансаминирования играют ключе­вую роль в промежуточном метаболизме, обеспечивая син­тез и разрушение аминокислот в живых клетках. Так, например, аминокислоты, глутаминовая, аспарагиновая кислоты и аланин, превращаются в соответствующие а-кетокислоты, являются компонентами цикла трикарбоновых кислот и могут служить источниками энергии. Простетической группой трансаминаз является пиридоксальфосфат, который осуществляет перенос аминогруппы [1].

В результате переаминирования, происходящего под действием АсаТ и АлаТ, образуются соответственно щаве- левоуксусная и пировиноградная кислоты.

Щавелевоуксусная кислота далее относительно легко превращается в пировиноградную кислоту, которая при добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной сре­де образует окрашенный гидразон пировиноградной кис­лоты. Интенсивность окраски гидразона, пропорциональ­ная концентрации пировиноградной кислоты, определя­ется колориметрически.

Оборудование: фотоэлектроколориметр, термостат, рН-метр, аналитические весы.

Посуда: пробирки — 15 шт.; пипетки на 0,2 мл — 2 шт., на 1 мл — 4 шт., на 10 мл — 1 шт.; колбы мер­ные на 100 мл — 6 шт., на 500 мл — 1 шт.

Реактивы: одно- и двухзамещенный фосфорнокислый натрий; D,L — аспарагиновая кислота; фенилаланин; а-кетоглутаровой кислоты динатриевая соль; 2,4-динитрофенилгидразин; натрий пировинограднокислый; натр едкий; соляная кислота.

Для приготовления реактивов используется дистил­лированная вода, свободная от карбонатов.

Приготовление растворов. Буферный раствор готовят путем смешивания 0,1 М растворов Na2HP04 и NaH2P04 до рН 7,4 на рН-метре.

Субстратный раствор для определения активности АсТ (реактив 1) готовят, растворяя 29,2 мг а-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г 1),£-аспарагиновой кислоты в 1 М раство­ре NaOH. Едкий натр приливают осторожно, небольшими порциями до полного растворения осадка и до достижения величины рН 7,4. Для измерения рН пользуются универ­сальной индикаторной бумагой или рН-метром. Раствор переливают в мерную колбу емкостью 100 мл, ополаскива­ют посуду фосфатным буфером рН 7,4 и доводят им объем до метки колбы. Полученный субстратный раствор тщательно перемешивают, прибавляют 1 каплю хлоро­форма и сохраняют в холодильнике в замороженном виде.

Субстратный раствор для определения активности АлТ (реактив 2) готовят, растворяя 29,2 мг а-кетоглутаровой кислоты и 1,78 г D,L-аланина, как описано выше при приготовлении реактива 1.

Раствор ДНФГ готовят, растворяя 19,8 мг ДНФГ в небольшом количестве 1 М раствора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После охлаждения объем доводят до 100 мл. Раствор оставляют на сутки, затем фильтруют и хранят в посуде из темного стекла в холо­дильнике. Срок годности — 1 год.