8. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Возникновение устойчивости микроорганизмов к действию антибиотиков.

Определение чувствительности бактерий к аб

Определение чувствительности к АБ методом бумажных дисков основано на диффузии антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана так, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-организмов были 28 – 32 мм. Бактерии исследуемого штамма (0,1 мл суспензии, находящейся в стационарной стадии роста) высевают на поверхность агаризованной среды в чашке Петри и распределяют шпателем. Затем стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных АБ. Засеянные чашки выдерживают в термостате. Если бактерии чувствительны к данному соединению, то вокруг дисков образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого мо к данному АБ. Метод серийных разведений АБ в жидкой питательной среде позволяет путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика количественно охарактеризовать его активность в отношении исследуемых мо. Для эксперимента необходимы: Питательные среды, обеспечивающие оптимальные условия роста исследуемого мо и не содержащие веществ, инактивирующих антибиотик; Растворы антибиотиков; Культуры МО, исследуемые на чувствительность к АБ. Работу начинают с приготовления растворов АБ. Для этого в ряд стерильных пробирок наливают по 2 мл ЖПС. В первую пробирку вносят 2 мл исходного раствора АБ и тщательно перемешивают смесь. После этого 2 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую, повторяя перемешивание, далее 2 мл из второй пробирки переносят в третью и т. д. Из предпоследней пробирки 2 мл раствора АБ удаляют. При таком способе разведения в каждой пробирке будет содержаться по 2 мл раствора АБ и в каждой последующей пробирке его концентрация будет в два раза меньше, чем в предыдущей. Среда в последней пробирке раствора АБ не содержит и является контрольной. После приготовления разведений во все пробирки вносят по 0,1 мл взвеси клеток с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 10⁵ – 10⁴ клеток. Пробирки перемешивают и помещают для выращивания при оптимальной температуре. Учет результатов проводят двояко: вначале просматривают пробирки, чтобы по помутнению среды определить наличие роста мо. Помутнение среды указывает на наличие высокой численности бактерий (более 10⁷ кл/мл). Среда в пробирках, в которых АБ находится в концентрациях, достаточных для подавления роста мо, остается прозрачной. Наименьшая концентрация АБ, при которой размножение мо уже не происходит, а содержимое пробирок остается прозрачным, соответствует наименьшей ингибирующей концентрации данного АБ в отношении изучаемого мо и рассматривается как бактериостатическая, что означает задержку роста бактерий, но не наличие их гибели. Для определения бактерицидной концентрации исследуемого АБ в отношении изучаемого мо(это значит, концентрации препарата, в которой он вызывает гибель клеток) проводят посев бактериологической петлей из пробирок, содержимое которых не помутнело, на полноценную питательную агаризованную среду. Отсутствие роста свидетельствует, что в данной пробирке мо полностью убиты данным АБ. Метод серийных разведений АБ в агаризованной среде позволяет в одном опыте проверить чувствительность к данному АБ нескольких мо. Разведения АБ готовят в стер.агаризованной среде. Для этого в нее добавляют требуемое количество исходного раствора АБ, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно чашки с наружной стороны делят маркером на стора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с помощью бактер.петли на отдельный стор в чашки с разными концентрациями АБ. Чашки помещают в термостат. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к АБ в такой его концентрации, при которой их рост полностью подавляется.

Генетическая детерминированность лекарственной устойчивости микроорганизмов, пути её преодоления. Устойчивость – рост бактерий не подавляется при min конц. АБ, подавляющего рост бактерий этого вида. Генет. инф. бактерий изменяется вследствие мутаций. Неустойчивые клетки погибают под действием АБ, а устойчивые продолжают размножаться. Генет. инф. об уст-ти может нести ДНК бактериальной хромосомы(хромосомная уст-ть) или плазмида в цитоплазме( внехромосомн. уст-ть).При хромосомной участки генома переходят из клетки в клетку при конъюгации(плазмиды), трансформации(через окр. среду) или трансдукции(умеренный фаг переносит). Внехромосомн. Плазмиды наз. R – фактор содержат уст-ть к нескольким АБ из разных классов одновременно. Размножаются в цитоплазме независимо от хромосомы(самореплецирующиеся единицы). Передают информацию при конъюгации от одних видов бактерий к другим. Гены уст-ти могут сод-ть и транспозоны. Источником генов резистентности может служить штамм-продуцент этого АБ, у которого эти гены для защиты от собствненного АБ. Тенденции преодоления уст-ти: - сокращение использования АБ в качестве профилактических средств; - периодическая замена используемых АБ с возвратом к старым; - увеличение лечебных доз, вводят прямо в очаг поражения для безопасности пациента; - применение в сочетании с др. препаратами(и АБ с АБ: увелич. спектр действия); - иммобилизация на носителях(липосомах: защита АБ, направленный транспорт, более длительно схраняется необходимая конц.).