7. Микроскопическая техника. Методы микроскопии микроорганизмов. Приготовление мазков для микроскопии. Определение живых и мертвых клеток методом окраски и микроскопии.

Для изучения формы, строения, размеров и процессов жизнедеятельности МО проводят микроскопические исследования. Обычно пользуются световым микроскопом, для более тонких исследований – электронную( больше разрешение). Исследования в темном поле – применяется яркое боковое освещение, получается изображение светящегося объекта на темном фоне; используют конденсор или объектив с затемненным центром. Люминесцентная микроскопия – объекты или красители(флюорохромы) светятся в УФ свете; микроскопы снабжены набором светофильтров. Фазово-контрастная микроскопия – при изучении размножения МО, живых объектов и неокрашенных препаратов; фазовый конденсор, содержащий кольцевую диафрагму и набор объективов, в которые вставлены фазовые пластины в форме кольца; положительный – темное изображение на светлом фоне или отрицательный – наоборот. Аноптральная микроскопия – микроскоп как в фазово-контратн., но пластинка фазового кольца объектива затемнена и задерживает 90% света; фон серый, объекты золотистые. Для изучения формы и выявления подвижности – раздавленная и висячая капля. Микроскопия окрашенных мазков позволяет изучить морфологические особенности и определить вид МО; патогенные убиваются; включает: приготовление мазка, фиксацию, высушивание, окраску. Окрашивают красителем, либо пропитанной краской бумагой. Простые способы окраски(быстро): водно-спиртовым раствором фуксина, метиленовым синим. Сложные способы(2 и более красящих веществ, обесцвечивающие вещества): по Грамму(МО могут быть грамполож., грамотр., грамвариаб.) - генциановый фиолетовый , люголь, спирт, вода, фуксин, вода, сушка (по Синеву фильтр. бумага пропитана кристаллич. фиолетовым); по Циль-Нильсену(для кислото- и спиртоустойчивых МО, окраш. в красный, остальные – в синий): фуксин Циля на фильтр. бумагу, нагреть до отхождения паров, остудить, снять, вода, метилен. синий 3-5 мин.

10. Методы изучения биологических признаков микроорганизмов и использование их для идентификации.

БХ, или ферментативные, свойства бактерий обусловлены ферментами, участвующими в расщеплении углеводов, белков, вызывающими окисление и восстановление субстратов. Каждый вид бактерий продуцирует постоянный для него набор ферментов. Характеристика БХ особенностей МО включает описание способности расти на различных ПС и вызывать определенные превращения веществ, входящих в состав этих сред. Для идентификации МО исследуют хим.состав и строение клет.стенки, серологические свойства, чувств-ть к фагам и другие особенности. Исследователь должен выяснить, является ли организм фототрофным, хемоавтотрофным или хемогетеротрофным, является он аэробом, анаэробом, микроаэрофилом или факульт.анаэробом, определить некоторые морф.свойства, окраску по Граму, форму клеток, специфические морфологические признаки (наличие спор, капсул и т. д.). Весьма важными являются три физиол. теста: на наличие каталазы, оксидазы и спос-ти к аэробному или анаэробному катаболизму УВ. Идентификацию МО облегчают знания об особых физиологических свойствах, присущих ему. Хаар-ка БХ особенностей включает описание способности расти на различных питательных средах и вызывать определенные превр.веществ, входящих в состав этих сред. Чаще учитывают природу источника углерода и энергии, форму азотсодержащих соединений, отношение к кислороду, ферментативную активность при выращивании в присутствии различных субстратов. Выявление ок-восст. ферментов:Выявление каталазы проводят на предметном стекле в капле 5 % перекиси водорода. Стерильной бактериологической петлей вносят исследуемую культуру и тщательно перемешивают. При наличии каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделением пузырьков кислорода. Выявление оксидазы при положит.реакции развивается розово-красная окраска. Выявление дегидрогеназ при положит.реакции развивается розово-красная окраска. Утилизация МО источников углерода: высевают на среды, содержащие в качестве единств.источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды. Для определения способности микроорганизмов использовать углеводы и спирты применяют агаризованные синтетические(на пов-ть агаризованной среды с углеводом или спиртом с помощью петли засевают штрихом испытуемые МО. Результаты учитывают по наличию роста культур в сравнении с ростом на контрольной чашке, не содержащей испытуемых соединений) или диф-диагн.среды Гисса(рост МОна средах с углеводами или спиртами может приводить к накоплению орг. кислот, нейтральных продуктов и газов. Обр.кислот регистрируется по изменению рН среды, о чем свидетельствует изменение окраски индикатора. Образование газа определяют по появлению на поверхности среды пены или разрывов и пузырьков в толще среды). Определение продукции гидролитических ферментов: многие МО способны использовать в качестве пит.субстратов различные высокомолекулярные соединения: полисахариды, белки, НК, липиды. Макромолекулы не могут проникать через ЦПМ и не используются МО. Первоначально под действием гидролитических ферментов, которые выделяются МОми, они переходят в низкомолекулярные продукты, которые с помощью специализированных транспортных систем поступают в бакт. клетки. Для выявления гидролитической способности МО в лаб.практике используются специальные методы: МО выращивают в питательной среде, которая содержит макромолекулярное соединение. Если клетки образуют экзоферменты, гидролизующие его, то вокруг колоний, образуется зона продуктов гидролиза. Опред.протеолитической активности: выявление протеаз, которые катализируют расщепление белков на поли- и олигопептидов. Активность последних определяют, используя в качестве субстратов, желатину, казеин и другие белки. Опред.амилолитической активности: посев МО на пов-ть полноценной ПС с крахмалом. Через 3 – 5 суток инкубирования на пов-ть среды в чашках Петри наносят раствор Люголя. При отриц.реакции пов-ть остается синей. Если бактерии гидролизуют крахмал, то ПС не окрашивается. Утилизация МОми орг.азотсодержащих веществ: большинство гетеротрофных МО могут усваивать азот органических соединений (белков, пептонов). В пр-се ферментативного гидролиза белка, выделяются АК, которые используются клеткой при анаболизме, подвергаются расщеплению в результате аэробного окисления или брожения до более простых соединений. В рез.разложение белков сопровождается выделением побочных продуктов: аммиака (при дезаминировании АК); сероводорода при использовании серосодержащих АК (цистин, цистеин, метионин), индола при утилизации триптофана. Обнаружение подобных продуктов свидетельствует об использовании вышеперечисленных соединений. Определение образования индола: определение одного из промежуточных продуктов разложения триптофана – индола. Определение образования сероводорода: используют индикаторные бумажки, пропитанные раствором уксуснокислого свинца. После соответствующего инкубирования в жидкой полноценной ПС выявляют почернение бумаги, которое свидет. об образовании сульфида свинца. Определение образования аммиака проводят после культивирования бактерий в жидкой полноценной ПС в присутствии индикаторной бумажки, пропитанной спец. реактивом. Об образовании аммиака свидетельствует покраснение бумаги.