2.2. Визначення активності супероксиддисмутази

Реактиви :

1) ЕДТА 0,08 мМ;

85 мг – 10мл Н₂О;

425 мг – 50 мл Н₂О;

2) N,N,N,N -тетраметилетилендиамін;

3) 0,1 М фосфатний буфер рН 7,8;

а) 0,2 М Na₂PO₄;

б) 0,2 М NaН₂PO₄;

4) Кверцетин 1,4 мкМ на диметилсульфоксиді у розрахунку 45,4 мл кверцетину на 10 мл диметилсульфоксиду або диметилформаміду.

Визначення активності СОД проводили у декілька етапів:

1. Готували реактив С. Для цього змішували 100 мл ЕДТА та 100 мл фосфатного буферу рН 7,8, потім суміш доводили N,N,N,N -тетраметилетилендиаміном до рН = 10.

2. Кверцетин переводили в рідкий стан, занурюючи у гарячу воду. Безпосередньо перед визначенням кверцетин розводили у розрахунку: 0,2 мл кверцетину доводили дистильованою водою до 2 мл.

У пробірку для контролю додавали 1мл реактиву С, 2,4 мл Н₂О, 0,1 мл кверцетину.

У дослідну пробірку додавали 1мл реактиву С, 2,3 мл Н₂О, 0,1 мл гомогенату, 0,1 мл кверцетину.

3. Суміші в обох пробірках перемішували і швидко вимірювали. Вимірювання проводили на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі λ = 406 нм проти контрольної проби кверцитину в нульовий момент (одразу після додавання кверцетину) та через 20 хв.

Активність СОД вираховували за формулою:

А _{(акт СОД)} = [(D’ – D’’/D’)·100] ·29,49 = од.акт/хв мг білка,

D’ = E_к вих. – Е_дослід 20 хв,

D’’ = Е_досл вих. – Е_досл 20 хв,

де А_{(актСОД)} – активність супероксиддисмутази;

D – значення оптичної густини;

Е – екстинкція.

2.3. Визначення активності каталази

Принцип методу базується на здатності Н₂О₂ утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс. Інтенсивність забарвлення перекисних сполук молібдену залежить від кількості Н₂О₂ в розчині (Королюк М.А., 1988). Каталаза, розкладаючи пероксид водню, зменшує інтенсивність забарвлення в пробі.

Реактиви:

1. 0,03 % розчин Н₂О₂;

2. 4 % розчин молібдату амонію;

3. 0,5 н Н₂SO₄ та 0,25 н Н₂SO₄

Каталазну реакцiю запускали додаванням 0,1 мл гомогенату до 2 мл Н₂О₂. У холосту пробу замість гомогенату вносили 1 мл молібдату амонію. Реакцію у дослідних пробірках зупиняли через 10 хвилин додаванням 1 мл розчину молібдату амонію. У контрольні проби додавали 0,1 мл гомогенату. Після ретельного перемішування до дослідних пробірок вносили по 1 мл 0,25 н Н₂SO₄, а до контрольних – по 1 мл 0,5 н Н₂SO₄.

Інтенсивність забарвлення контрольної та дослідної проб визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 410 нм проти води.

Активність каталази визначали за фомулою:

А_кат = ΔЕ·0,18/С

де Е – різниця екстинкції пустої та дослідної проб;

0,18 – молярний коефіцієнт екстинкції комплексу Н₂О₂ з молібдатом амонію рівний 22200 М^-1см^-1, в розрахунках використовували величину мілімолярного коєфіцієнта екстинкції, виражену як 22,2 см^-1∙мкмоль^-1;

С – концентрація бiлка.

Отримані результати виражали в мкмоль Н₂О₂/хв мг білка.

2.4. Визначення активності глутатіонпероксидази

Мірою активності ферменту глутатіонпероксидази є швидкість окиснення глутатіону в присутності гідропероксиду третинного бутилу (Моін В.М., 1986).

Реактиви:

1. Трис-НСl буфер 0,1 М (рН 8,5).

2. Трис-НСl буфер 0,1 М (рН 8,5), який містить 6 мМ ЕДТА та 12 мМ азид натрію. Безпосередньо перед аналізом на цьому буфері готували 4,8 мМ розчин відновленого глутатіону.

3. Гідропероксид третинного бутилу 20 мМ (готували перед аналізом розведенням вихідного реактиву в 500 разів).

4. ТХО (20 %).

5. Реактив Елмана – 0,01 М (3,96 г∙л^-1) ДТНБК на метанолі.

Хід визначення.

100 мкл гомогенату інкубували із 830 мкл реактиву 2 впродовж 10 хв при 37 С, додавали 70 мкл реактиву 3 та інкубували 5 хв. Реакцію зупиняли додаванням 0,2 мл холодної ТХО, осаджені білки видаляли центрифугуванням при 8000 об/хв. До 100 мкл супернатанту додавали 10 мл трис-НСl буферу (реактив 1) та 100 мкл реактиву Елмана. Через 5 хв проби фотометрували у кюветі із довжиною оптичного шляху 1 см при 412 нм.

Контрольна проба відрізнялася тим, що дослідний зразок вносили безпосередньо перед осадженням білків. Із урахуванням розведення біологічного матеріалу в даній методиці і коефіцієнта молярної екстинкції ТНФА при 412 нм – 11400, розраховували активність ГПО в мкМ використаного в реакції субстрату за формулою:

мкмоль G-SH/хв∙мг білка,

де А_ГПО – активність глутатіонпероксидази;

ΔЕ – різниця екстинції за час реакції;

α – об’єм трис-HCl буфера, гідропероксиду трет-бутилу, розчину ТХО;

b – об’єм супернатанту, трис-HCl буфера та реактиву Елмана;

ε – молярний коефіцієнт екстинкції тіонінтрофенільного аніона, дорівнює 11400 М^-1·см^-1, у розрахунках використовували мілімолярний коефіцієнт екстинкції, виражений як 11,4 см²/мкмоль;

V_super – об’єм супернатанту (0,02 мл);

V_тк.фр – об’єм тканинної фракції;

t – час реакції;

С – концентрація білка, мг/мл;

α – об’єм проби, яку вносять у кювету;

l – довжина оптичного шляху (1 см)

Отримані результати виражали в мкмоль G–SH/хв∙мг білка.