Ексклюзійна х.

Один із видів рідинної хроматографії, де НФ служить гелеподібні полімери, що випадково затримують молекули того компонента суміші, який здатен проникнути в гель. Це найпростіший метод Х, в якому молекули речовини не мають спорідненості до РФ або НФ. НФ в цьому виді хроматографії представлена рідиною, що представлена рідинною, що перебуває всередині пористих гранул, які омиваються також і РФ.

Завдяки силам щеплення з поверхнею пористого матеріалу, який утворює гранула, рідина всередині пор омивається швидше або повільніше в залежності від їх ширини.

Гель фільтрацією РФ є водно сольові розчини. Утримання молекул визначається імовірністю проникнення молекул в пори. Великі молекули не будуть затримуватися у порах і будуть виходити разом з РФ . Пористі матеріали для гель фільтрації випускають у вигляді сферичних гранул різних діаметрів.

Тип сифадекса відрізняється розмірами пор. Чим більший номер сифадекса, тим менші пори мають його гранули. Залежно від типу сифадекса, буде по-різному проходити розділення.

Існують такі сифадекси: Сж-10, Сж-75, Сж-200.

Вихідним матеріалом для сифадексних матеріалів є полісахариди, утворенні бактерією Leuconostoc Mesenteroides.

Високоефективна рідинна хроматографія

Процеси рідинної хроматографії низького тиску протікають зшвидкістю, яка залежить від розміру гранул. У звичайній рідинній хроматографії використовують сферичні гранули з широким діапазоном розміру (діаметром 20-300 мікронів). Ефективність колонки пов'язана з в’язкістю, коефіцієнтом дифузії та іншими фізичними властивостями рідин

Для прискорення процессу хроматографію проводять під тиском. Застосування тиску робить метод більш динамічним і ефективним, що відображається в назві – високоефективна рідинна хроматографія — один з ефективних методів розділення складних сумішей речовин.

Характеристики колонок.

· довжина від 100 до 250 мм;

· внутрішній діаметр від 1 мм (аналітичні) до 20-30 мм

(препаративні);

· падіння тиску: переважно 40-60 атм.

Колонки виготовляють найчастіше з нержавіючої сталевої полірованої трубки, наповненої нерухомою фазою (наприклад, модифікованим силікагелем) і закритої з обох кінців перехідниками, що дозволяє підключати її до вхідної та вихідної ліній. Використовують також скляні колонки, вміщені в металічний кожух. Колонки витримують тиск порядку 150 атм.

Оскільки частки носія в колонках для ВЕРХ упаковані дуже щільно, під час відсутності високого тиску швидкість потоку через них незначна. Тому такі колонки звичайно поміщають у сталеві циліндри, з'єднані зі складною системою насосів і шлангів, які забезпечують тиск, необхідний для високої швидкості протікання. В умовах ВЕРХ відбувається швидке врівноважування розчинів із внутрішнім вмістом сфер малого діаметру, так що розчини, які володіють різною спорідненістю до матриксу, ефективно розділяються при високій швидкості потоку

При роботі з цим видом хроматографії необхідно враховувати деякі особливості методики:

а) колонки для ВЕРХ наповнюють носієм з дуже малим діаметром частинок. У результаті при об'ємних швидкостях розчинника, які необхідні для швидкого розділення проби, на колонці створюється високий тиск;

б) детектори, що застосовуються у ВЕРХ, чутливі до флуктуації потоку і тиску елюента. Флуктуація – відхилення значення фізичної величини від середнього в певний момент часу;

в) процес хроматографічного розділення супроводжується рядом антагоністичних ефектів, так, наприклад, диспергування (тонке подрібнення) зразка в рухомій фазі веде до змішування компонентів суміші і знижує максимальну концентрацію речовини у її фракції, що проходить через детектор і потім виходить у вигляді піка. Диспергування спостерігається на всіх ділянках системи від місця введення проби до детектора;

г) розчинники, що виконують роль рухомої фази, часто здатні викликати корозію апаратури. Це, в першу чергу, відноситься до розчинників, що використовуються у обернено фазовій хроматографії, яка найчастіше застосовується у ВЕРХ в біохімії

Детектори. Найчастіше застосовують ультрафіолетові детектори, тому що більшість органічних речовин поглинає світло при 210 нм (С=О) та 250 нм (ароматичні кільця).

За механізмом розділення аналізованих або розділювальних речовин ВЕРХ ділиться на адсорбційну, розподільну, іонообмінну, ексклюзійну, лігандообмінну та інші.

Адсорбційна ВЕРХ.

Найбільше застосування у ВЕРХ знаходять адсорбенти із силікагелю з різним об'ємом та діаметром пор, тому що недостатня механічна міцність більшості інших адсорбентів не дозволяє впаковувати їх у колонку та використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ. Недоліки: - тривалість процесів урівноваження адсорбентів з розчинниками, що містять воду в мікрокількостях; -труднощі приготування таких розчинників з певною вологістю; -недостатня відтворюваність параметрів утримання, селективності; -неможливість використання градієнтного елюювання; - часті випадки перегрупувань чутливих до каталізу сполук, їх розкладання, незворотна сорбція, яка призводить до накопичення речовин на початковій ділянці колонки, зміни природи сорбенту, підвищення опору колонки.

Розподільна ВЕРХ – це варіант ВЕРХ, у якому розділення суміші на компоненти здійснюється за рахунок відмінності їх коефіцієнтів розподілу між двома фазами, що не змішуються: розчинником (рухома фаза) та фазою на сорбенті (нерухома фаза) з використанням прищеплено-фазного сорбента.

Іонообмінна ВЕРХ. Розділення компонентів суміші досягається за рахунок зворотної взаємодії речовин, що іонізуються, з іонними групами сорбенту. У якості рухомої фази використовують водні розчини солей кислот, основ і розчинники типу рідкого аміаку, тобто системи розчинників, що мають високе значення діелектричної проникності. Елюцію проводять буферними розчинами, що дозволяє регулювати рН.

Ексклюзійна ВЕРХ (гель-проникаюча, а у водних системах — гель- фільтраційна) являє собою варіант рідинної хроматографії, у якому розділення відбувається за рахунок розподілу молекул, що перебувають усередині пор сорбенту, і тими, що знаходяться між його частинками. Принциповою особливістю методу є можливість розділення молекул за розміром в діапазоні практично будь-яких молекулярних мас — від 10² до 10⁸, що робить його незамінним для дослідження синтетичних біополімерів. Рухома фаза може бути будь-який розчинник, що розчиняє компоненти суміші та часто використовують ацетон, дихлор етан в суміші з водою. Нерухома фаза використовують полімери, сорбенти, силікагелі.

Обернено-фазова ВЕРХ. У якості рухомої фази, зазвичай, використовують суміші розчинників, оскільки це дозволяє поліпшити селективність і ефективність розділення й зменшити час, необхідний для його проведення. Змінюючи склад рухомої фази, можна регулювати час утримання в дуже широких межах. Майже для всіх аналізованих сполук час утримання в деяких чистих розчинниках (метанол, тетрагідрофуран) дуже малий, а в чистій воді надзвичайно великий, тому використовують суміші води з органічним розчинником – так званим модифікатором. Оберненофазова хроматографія широко застосовується не тільки для розділення нейтральних сполук, але й іоногенних речовин. Залежно від рН середовища змінюється співвідношення різних форм у розчині і фактори утримання.

Хіральна ВЕРХ. Хіральність (з грец. «рука») – здатність будь-якого об'єкта мати своє дзеркальне відбиття. Синонім — дисиметрія. Хіральні молекули також називають оптично-активними, оскільки вони по різному взаємодіють із світлом різної кругової поляризації. Однакові за хімічним складом та структурою молекули, які відрізняються хіральністю, називаються енантіомерами, або L (лівий) та D (правий)-ізомерами. Хіральна хроматографія – це розділення, у якому хіральна нерухома фаза селективно втримує один з енантіомерів більш міцно, ніж інший. Для пояснення розділення оптичних ізомерів запропонований ряд моделей хірального розпізнавання, які в багатьох випадках засновані на моделі «трьохточкової взаємодії», висунутої Далглішем в 1952 р. Згідно із цією теорією, для хірального розпізнавання необхідні три одночасних контакти між енантіомером і нерухомою фазою.

Хіральна рідинна хроматографія застосовується для розділення й кількісного аналізу дзеркальних ізомерів (енантіомерів) оптично активних органічних сполук. Оскільки різні енантіомери біологічно активних речовин мають різну дію на організм, хіральна хроматографія найчастіше застосовується для аналізу фармацевтичних препаратів і продуктів їх синтезу.

Надкритична флюїдна хроматографія Проміжне положення між рідинною та газовою хроматографією займає надкритична флюїдна хроматографія, коли рухомою фазою служить стиснений газ.

Критична точка- це стан речовини, в якому дві або більше фаз цієї речовини знаходяться в термодинамічній рівновазі. При наближенні до критичного стану властивості речовини змінюються.

Потрійна точка речовини – це певне значення температури та тиску, при яких речовина може існувати одночасно у вигляді 3 фаз.

Надкритичний флюїд (НКФ) — це стан речовини, при якому зникає відмінність між рідкою й газоподібною фазами. При збільшенні температури та тиску вище потрійної точки можна досягнути таких значень, коли зникне відмінність між рідкою.

Надкритична флюїдна хроматографія забезпечує високоефективне розділення багатокомпонентних сумішей, включаючи олігомерні молекули. Екологічна нешкідливість елюенту (двоокису вуглецю) відрізняє цей метод від інших методів хроматографії. Досить перспективним є застосування надкритичної флюїдної хроматографії у фармацевтичній промисловості.