Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

2.1. Характеристика об'єкту дослідження

Для вирішення поставлених завдань було проведено дослід на білих щурах. Дослід тривав протягом 21 доби. Тварин підбирали за принципом аналогів, по 20 голів у кожній групі. Досліджували дію гістаміну на функціональні зміни нирки щура.

Дослідження проводили в лабораторії кафедри біофізики та біоінформатики Львівського національного університету імені Івана Франка.

Перша група тварин служила контролем. Тваринам другої та третьої груп на протязі 14-ти днів підшкірно вводили розчини гістаміну, концентрацією 1 та 8 мкг/кг відповідно (як вихідний розчин використовували 0,01 % гістаміну дигідрохлорид). На 1-шу, 7-му, 14-ту та 21-шу (реабілітація) доби по п’ять тварин з кожної групи декапітували під легким ефірним наркозом (табл. 1). Швидко відбирали праву нирку для проведення досліджень.

Таблиця 1.

Схема досліду

	Відбір досліджуваних зразків
Групи тварин	1 доба	7 доба	14 доба	21 доба
І (контроль)	–	–	–	–
ІІ	Гістамін, 1 мкг/кг	Гістамін, 1 мкг/кг	Гістамін, 1 мкг/кг	–
ІІІ	Гістамін, 8 мкг/кг	Гістамін, 8 мкг/кг	Гістамін, 8 мкг/кг	–

У відібраних зразках визначали стан системи антиоксидантного захисту за активністю супероксиддисмутази (Костюк В.А., 1990). Кількість білка у кожному зразку визначали за методом Лоурі (Lowry O.H., 1951).

Дані досліджень статистично обробляли з вираховуванням середніх арифметичних величин (М), стандартної похибки (m) і степінь вірогідності різниці (р), між показниками. Статистичну обробку усіх даних результатів досліджень проводили з використанням програми „Excel-97” для Windows.

2.2. Визначення активності супероксиддисмутази

Реактиви :

1) ЕДТА 0,08 мМ;

85 мг – 10мл Н₂О;

425 мг – 50 мл Н₂О;

2) N,N,N,N -тетраметилетилендиамін;

3) 0,1 М фосфатний буфер рН 7,8;

а) 0,2 М Na₂PO₄;

б) 0,2 М NaН₂PO₄;

4) Кверцетин 1,4 мкМ на диметилсульфоксиді у розрахунку 45,4 мл кверцетину на 10 мл диметилсульфоксиду або диметилформаміду.

Визначення активності СОД проводили у декілька етапів:

1. Готували реактив С. Для цього змішували 100 мл ЕДТА та 100 мл фосфатного буферу рН 7,8, потім суміш доводили N,N,N,N -тетраметилетилендиаміном до рН  10.

2. Кверцетин переводили в рідкий стан, занурюючи у гарячу воду. Безпосередньо перед визначенням кверцетин розводили у розрахунку: 0,2 мл кверцетину доводили дистильованою водою до 2 мл.

У пробірку для контролю додавали 1мл реактиву С, 2,4 мл Н₂О, 0,1 мл кверцетину.

У дослідну пробірку додавали 1мл реактиву С, 2,3 мл Н₂О, 0,1 мл гомогенату, 0,1 мл кверцетину.

3. Суміші в обох пробірках перемішували і швидко вимірювали. Вимірювання проводили на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі  = 406 нм проти контрольної проби кверцитину в нульовий момент (одразу після додавання кверцетину) та через 20 хв.

Активність СОД вираховували за формулою:

А _{(акт СОД)} = [(D’ – D’’/D’)·100] ·29,49 = од.акт/хв мг білка,

D’ = E_к вих. – Е_дослід 20 хв,

D’’ = Е_досл вих. – Е_досл 20 хв,

де А_{(актСОД)} – активність супероксиддисмутази;

D – значення оптичної густини;

Е – екстинкція.