2.5. Биополимеры

Термин «биополимеры» относится ко многим высокомолекулярным

соединениям (полисахаридам, липидам, полиоксиалканоатам), которые

являются для клеток резервными веществами и синтезируются в специ-

фических условиях несбалансированного роста. Такими условиями, как

правило, являются избыток углеродного и энергетического субстратов в

среде и дефицит отдельных минеральных элементов (азота, фосфора, се-

ры, магния и т.д.), лимитирующих синтез азотсодержащих компонентов и

скорость роста клеток. Многие микробные биополимеры являются эндо-

генным источником углерода и энергии, поэтому способствуют сохране-

нию выживаемости клеток в неблагоприятных условиях среды.

Полисахариды

Полисахариды (гликаны) – полимеры, построенные не менее чем из

11 Моносахаридных единиц. Полисахариды являются обязательным ком-

понентом всех организмов, присутствуют как изолированно, так и в ком-

плексах с белками, липидами, нуклеиновыми кислотами. Полисахариды

преобладают в растительных биомассах и составляют, следовательно,

большую часть органического материала на планете. Полисахариды раз-

нообразны по строению, локализации в клетках и, естественно, по своим

физико-химическим свойствам. Особенно разнообразны полисахариды,

синтезируемые микроорганизмами. Микробные полисахариды делятся на

внутриклеточные, локализованные в цитоплазме, и внеклеточные – поли-

сахариды слизей, капсул, чехлов. Многие полисахариды биологически

активны и повышают устойчивость макроорганизмов к вирусной и бакте-

риальной инфекциям, обладают противоопухолевым действием, а также

антигенной специфичностью. Поэтому они находят все более широкое

применение в медицине и фармацевтической промышленности в качестве

диагностикумов, заменителей плазмы крови и пр. Чрезвычайно широки

перспективы применения полисахаридов в связи с их гелеообразующими

и реологическими свойствами в качестве загустителей сиропов и космети-

ческих средств, для упаковки продуктов и протравливания семян. Водные

растворы отдельных полисахаридов чрезвычайно стабильны в широких

интервалах рН и температуры, поэтому находят применения при добыче

нефти и газа; флоккулирующие свойства гликанов используют в процес-

сах очистки, концентрирования и разделения металлов. Возможности по-

лисахаридов раскрыты далеко не полностью, поэтому их изучение ведет к

расширению сферы применения.

82

Большинство микроорганизмов синтезируют полисахариды из разно-

образных источников углерода, обеспечивающих их рост, – углеводов,

спиртов, карбоновых кислот, С1-соединений. Природа и концентрация

углеродного источника в среде существенно влияет на образование поли-

сахаридов, которое сводится к созданию гликозидной связи между моно-

сахаридными единицами (рис. 2.5); при этом гликозильный донор переда-

ет гликозил на акцептор-затравку, высвобождаясь при этом. Акцепторами

служат олигосахара и недостроенные полисахариды. Часто первичным

акцептором служат олигосахара, в ряде случаев – недостроенный полиса-

харид – «затравка». Полимеризация идет до образования готового полиса-

харида с участием специфических гликозилтрасфераз, которые отщепля-

ют фрагменты линейной цепи недостроенного гликана и переносят их на

ту же или аналогичную цепь в определенном положении.

Синтез полисахаридов определяется условиями культивирования про-

дуцента и составом питательной среды, которые определяют возможность

и интенсивность их образования, а также состав, структуру и, следова-

тельно, свойства. Существенное значение имеют не только качественный

состав используемого углеродного сырья, но также и концентрация, так

как эффективный синтез полисахаридов осуществляется на средах с высо-

ким содержанием углеродного субстрата. Количество и форма источника

азота, не влияя на состав полисахаридов, оказывает влияние на скорость

роста микроорганизмов и количественных выход полисахаридов. Сущест-

венна также роль фосфатов и ионов марганца, магния, кальция, являю-

щихся кофакторами синтеза полисахаридов. Разнообразно и специфично

влияние рН и температуры среды на накопления гликанов. Существенен

хороший уровень аэрации культуры. Производство полисахарив специ-

фично для каждого и определяется природой, локализацией, свойствами, а

также областью применения гликанов и, безусловно, физиологическими

особенностями продуцента. Получение экзополисахаридов эффективнее

внутриклеточных, так как их концентрация выше, меньше проблем на ста-

дии выделения и очистки, однако в ходе ферментации возникают трудно-

сти с транспортом кислорода из газовой фазы в жидкую (при повышении

экскреции гликанов в среду ее вязкость возрастает). Следствием этого

становятся снижение роста клеток и торможение продукции полисахари-

OH OR

OH

CH2OH

OH

OH

OH

CH2OH

OH

OH

+ ROH

n n + 1

Фермент

+

O - …

OH

CH2OH

OH

O - …

OH

CH2OH

OH

Рис. 2.5. Схема образования гликозидной связи.

83

дов. Поэтому среду приходится разбавлять в десятки раз и после удаления

клеток продуцента – концентрировать.

Спектр промышленных продуцентов и выпускаемых полисахаридов

весьма разнообразен (табл. 2.3). Ведущими странами – производителями

полисахаридов являются: США, Франция (ксантан, курдлан), Россия (дек-

стран), Япония (пуллан, курдлан).

Технология получения декстранов

Продуцентами декстранов являются штаммы Leuconostac mesenteroides,

растущие на средах с высоким содержанием сахарозы (10–30 %),

дестраном-«затравкой», дрожжевым экстрактом и минеральными солями.

В зависимости от состава минеральных солей и той или иной природы

«затравки» синтезируются высокомолекулярные (60–80 тыс.) линейные

или имеющие низкую молекулярную массу (20–30 тыс.) разветвленные

декстраны. Последние обладают наибольшей биологической активностью.

Из декстранов выпускают плазмозаменители (клинический декстран, по-

лиглюкин, плазмодекс, хемодекс и др.).

Типичный пример ферментации – глубинная периодическая культура,

реализуемая на первом этапе с целью образования биомассы продуцента

при избытке сахаров и рН 6.5–8.0. Синтез декстрансахаразы, ведущий к

образованию гликанов, наиболее интенсивен при рН около 7.0. Помимо

ионов магния синтез декстранов стимулируется при замене сахарозы ме-

лассой. Бактерии расщепляют сахарозу с образованием глюкозы и фрук-

тозы. Последняя сбраживается по гетероферментному пути с образовани-

ем молочной и уксусной кислот, маннита и углекислоты. Глюкоза быстро

полимеризуется в декстран. Процесс завершается через 24 ч. Выделение

декстрана из культуры проводят метанолом, для последующей очистки –

многократно растворяют в воде, переосаждают метанолом и фракциони-

руют. Декстрансахараза является экзоферментом, и ее концентрация в

культуральной среде значительна. Поэтому возможен процесс получения

полисахарида на основе растворимого фермента. Культуральная жидкость

Т а б л и ц а 2 . 3

Промышленные микробные полисахариды (по Gruger, Gruger, 1984)

Полисахарид Продуцент

Ксантан Xanthomonas campesrtis

Альгинат Pseudomonas aeruginosa,

Azotobacter vinelandii

Курдлан Alcaligenes

Склероглюкан Sclerotium glucanicum, S. delphinii, S. rolfsii

Пуллан Pullularia pullulans

Декстран Acetobacter sp., Leuconostac mesenteroides,

L.dextranicum, Streptococcus mutans

84

с декстрансахаразой при рН около 5.0 и 15°С способна около месяца про-

являть высокую ферментативную активность. Реализован процесс на ос-

нове культуральной среды с ферментом, содержащей сахарозу и декстран-

«затравку», – процесс полимеризации завершается в течении 8 ч. Этот

способ значительно упрощает процедуру ферментации и стадию выделе-

ния и очистки декстрана и позволяет в контролируемых условиях полу-

чать продукт заданной молекулярной массы. Перспективы имеет также

процесс на основе иммобилизованной декстрансахаразы. В середине 90-х

гг. начат выпуск коньюгатов модифицированного декстрана с ферментом

стрептокиназой. Препарат представляет собой пролонгированную декст-

раном форму стрептокиназы.

Ксантан

Ксантан, продуцируемый бактериями Xanthomonas campesrtis, облада-

ет уникальными реологическими свойствами. В низких концентрациях он

образует очень вязкие растворы и обладает псевдопластичностью; его рас-

творы не изменяют свои реологические свойства при изменении темпера-

туры, рН, солености в широких пределах.

Ксантан применяют в пищевой промышленности, при изготовлении

гелевых дезодорантов, зубной пасты, при суспендировании сельскохозяй-

ственных химикатов, используют при добыче нефти. Объемы производст-

ва ксантана – наиболее крупнотоннажны из всех других гликанов. Товар-

ное название выпускаемого продукта (ксантан, келцан, келтрол).

Получают ксантаны в условиях периодической глубинной культуры на

средах, содержащих 1–5 % углеводов (кукурузный крахмал, сахар-сырец

или меласса), а также органические соединения азота, двузамещенный

фосфорнокислый калий, микроэлементы. Ферментация длится в течение 3

суток при 28°С и рН 6.5–7.2 в две фазы: на первой реализуется рост кле-

ток и накопление биомассы, на второй при дефиците азота в среде проис-

ходит образование полисахарида. Осаждают полисахарид из культураль-

ной жидкости метанолом, полученный осадок высушивают.

Альгинат

________Данный полисахарид ранее выделяли из морской водоросли Laminaria.

Альгинат обладает в определенных условиях прекрасными гелеобразую-

щими, а также псевдопластическими свойствами в широком диапазоне рН

и температур, и используется в кондитерской и фармацевтической про-

мышленности. Установлено, что альгинат является лучшим носителем для

иммобилизации ферментов и, особенно, целых клеток. Сравнительно не-

давно среди бактерий идентифицированы продуценты полисахарида,

близкого альгинату (Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter vinelandii). Про-

цесс реализован в промышленности на средах с избытком углерода. Варь-

ируя концентрацию фосфата в среде, можно влиять на молекулярную мас-

су синтезируемого полимера, а при изменении концентрации кальция из-

85

меняется соотношение моносахаридов, входящих в состав данного глика-

на, следовательно, и его свойства.

Курдлан

Бактерии Alcaligenes faecalis штамм 10С3 синтезируют курдлан, пред-

ставляющий собой полимер глюкозы. Важное свойства данного полисаха-

рида – образование термически необратимых гелей. При нагревании свы-

ше 64°С происходит гелеобразование курдлана; прочность геля не изме-

няется в диапазоне температур 60–80° и существенно возрастает при уве-

личении температуры свыше 120°, при этом одиночная спираль переходит

в тройную. Курдлан нерастворим в холодной воде.

Курдлан обладает противоопухолевой активностью, поэтому находит

применение в медицине. Ацетильные производные курдлана применяют в

качестве основы ультрафильтрационных полупроницаемых мембран для

разделения веществ с молекулярной массой 200–2000. Ферментация про-

текает в глубинной периодической культуре в речение 80 ч на средах, со-

держащих 8 % глюкозы; выход полисахарида составляет около 40 г/л. В

связи с привлекательностью свойств данного продукта технология его

получения интенсивно совершенствуется.

Пуллан

Полисахарид продуцируется дрожжеподобным грибом Aerobasidium

pullulans на средах, содержащих 50 % глюкозы в течение 80–100 ч. Вяз-

кость пуллана зависит от рН среды: она минимальна при рН 4.0, молеку-

лярная масса при этом составляет около 200 тыс., при увеличении рН мо-

лекулярная масса возрастает. Пуллан используют в качестве биоразру-

шаемого упаковочного материала для пищевых продуктов; он обладает

также антиокислительными свойствами.

Склероглюкан

Склероглюкан (товарное название – политран) синтезируют грибы ро-

да Sclerotium. Синтез данного полисахарида в отличие от большинства

других максимален в ранней лог-фазе 48-ч культуры. Процесс разработан

на средах с глюкозой, в том числе в проточном режиме, выход полисаха-

рида от ассимилированной глюкозы составляет 50 %. В низких концен-

трациях (1.5 % растворы) образует в воде прочные гели, которые не изме-

няют свои свойства в широком интервале температур. Используют в каче-

стве покрытия семян, пестицидов, а также при производстве латексов и

красителей.

Задачей биотехнологии является совершенствование микробиологиче-

ских процессов получения полисахаридов на основе улучшенных штам-

мов-продуцентов при расширении сырьевой базы за счет замены дорого-

стоящих сахаров более доступными субстратами, а также модификация

физико-химических свойств самих гликанов.

86

Микробные полиоксиалканоаты

Полиоксиалканоаты (ПОА) – биополимеры оксипроизводных жир-

ных кислот, синтезируются многими прокариотическими микроорганиз-

мами в специфических условиях несбалансированного роста при избытке

углеродного и энергетического субстрата в среде и дефиците минераль-

ных элементов (азота, серы, фосфатов и др.), а также кислорода. Среди

наиболее перспективных продуцентов ПОА – Azotobacter, Bacillus,

Methylomonas, Pseudomonas, Alcaligenes.

Наиболее изученным в настоящее время является полиоксибутират –

полимер β-оксимасляной кислоты (С4Н8О2). Молекулярная масса полиме-

ра определяется условиями синтеза полимера, спецификой продуцента, а

также процедурой экстракции полимера из биомассы. Помимо полиокси-

бутирата, микроорганизмы способны синтезировать гетерополимерные

ПОА – сополимеры оксибутирата и оксивалерата, оксибутирата и окси-

гексаноата, полиоксибутирата и полиоксигептаноата и др. а также трех-,

четырех- и более компонентные полимеры. Таким образом, химический

состав и, как установлено в последние два-три года, отдельные физико-

химические свойства (молекулярный вес, кристалличность, температур-

ные характеристики, скорости биодеградации, механическая прочность)

могут существенно варьировать. Это открывает пути для получения в бу-

дущем полимерных материалов с заданными свойствами.

Практический интерес и значимость данных исследований определя-

ются свойствами полиоксиалканоатов, которые по своим базовым показа-

телям близки к полипропилену (табл. 2.4), но обладают также рядом уни-

кальных свойств, включая совместимостью с животными тканями, опти-

ческую активность, пьезоэлектрические и антиоксидантные свойства и,

самое главное, биодеградабельность.

Свойства ПОА делают их перспективными для применения в различ-

ных сферах: медицине и хирургии (прочный рассасываемый хирургиче-

ский материал, элементы для остеосинтеза, сосудистой пластики, пленоч-

ные покрытия ран и ожоговых поверхностей, одноразовые изделия, в т.ч.

нетканые материалы), фармакологии (пролонгация действия лекарствен-

ных веществ), пищевой промышленности (предупреждение окислитель-

ной порчи напитков и продуктов, упаковочные материалы), сельском хо-

зяйстве (обволакивание семян, покрытие удобрений и пестицидов), радио-

электронике, коммунальном хозяйстве (различные разрушаемые тара и

упаковочные материалы) и пр.

87

Синтез полиоксибутирата и других ПОА в принципе возможен с ис-

пользованием различного сырья: сахаров, спиртов, ацетата, а также водо-

рода и углекислоты (табл. 2.5).

Углерод, ассимилированный клетками тем или иным путем, превраща-

ется в пируват, который декарбоксилируется с образованием ацетил-КоА.

Последний включается в реакции цикла трикарбоновых кислот, и при на-

рушениях в системах амфиболизма, вызванных дефицитом структурных

элементов для синтеза белка, не становится предшественником аминокис-

лот, а подвергается поликонденсации, далее восстанавливается с участием

НАДН в реакциях β-окисления в оксимасляную кислоту, которая подвер-

гается полимеризации с образованием полиоксибутирата:

Т а б л и ц а 2 .4

Сравнение свойств полиоксибутирата (ПОБ) и полипропилена (ПП) (по D. King, 1982)

Свойства ПОБ ПП

Температура плавления (°С) 175 176

Прозрачность (%) 80 70

Молекулярный вес (D) 5.105 2.105

Температура стеклования (°С) 15 -10

Удельный вес (г/см3) 1.250 0.905

Модуль изгиба (ГПа) 4.0 1.7

Прочность на разрыв (МПа) 40 38

Растяжение на разрыв (%) 6 400

Устойчивость к ультрафиолету хорошая плохая

Устойчивость к растворителям плохая хорошая

Т а б л и ц а 2 .5

Затраты сырья и выход полиоксибутирата на различных субстратах (по Collins, 1987)

Субстрат Цена, долл/т Выход ПОБ, т/т субстрата Затраты, долл/т ПОБ

Метанол 110 0.18 610

Этанол 440 0.50 880

Ацетат 370 0.33 1220

Декстроза 360 0.33 1180

Тростниковый сахар 200 0.33 500

Водород 500 1.0 500

88