II. Практическая часть

2. Методы определения чувствительности к антибиотикам.

2.1 Диффузионные методы. Дискодиффузионный метод с использованием диспенсеров с катриджами. Современная методика определения чувствительности бактерий к антибиотикам включает использование диспенсера с катриджами, заполненами дисками пропитанными различными антибиотиками ( одновременно до 6 видов антибиотиков).

Алгоритм постановки методики включает следующие этапы:

1. Подготовка исследуемой культуры больного (использовать только чистые культуры):

1.1 Пересеять чистую исследуюмую культуру в 4 – 5 мл соответствующего бульона, например триптиказо-соевого бульона Trypticase Soy Broth (или бульона Мюллера-Хинтона Mueller Hinton Broth для микроорганизмов, требовательных к питательным средам).

1.2 Определить количество микробных тел с помощью стандарта мутности. При необходимости разбавить суспензию для достижения соответствия стандарту Макфарланда (0,5 единиц). В качестве растворителя использовать стерильный бульон или физиологический раствор

2. Посев подготовленной микробной суспензии на поверхность агара Мюллера-Хинтона Mueller Hinton Agar (или другого соответствующего агара)осуществляется:

2.1 капельным методом – 1 мл супензии распределяют по поверхности чашки качанием и излишек отсасывают в дезраствор

2.2 с использованием стерильного тампона опущенного в приготовленную суспензию Отжать его несколько раз о верхний край внутренней стороны стенки пробирки с суспезией для устранения избытка жидкости.

Засеять штрихами всю поверхность агара Мюллера-Хинтона Mueller Hinton Agar (или другого соответствующего агара) трижды, поворачивая чашку на 60° между мазками для обеспечения равномерного посева.

26

Необходимо оставить крышку открытой на 3 – 5 минут, но не более, чем на 15 минут, чтобы дать влаге, оставшейся на поверхности, впитаться до наложения дисков, пропитанных антибиотиками.

3. Зарядить диспенсер катриджами с дисками с соответствующими антибиотиками.

4. Наложить диски с помощью диспенсера BBL Sensi-Disc, соблюдая правила асептики. Располагайте диски так, чтобы расстояние между их центрами составляло не менее 24 мм. Рекомендуется накладывать диски с пенициллином и цефалоспорином на расстоянии не менее 10 мм от края чашки Петри и с расстоянием между центрами не менее 30 мм. Избегайте расположения дисков рядом друг с другом.. Если диски были наложены не с помощью автоматически наполняемых диспенсеров, прижмите их стерильной иглой или пинцетом для обеспечения контакта с поверхностью.

5. Поместить чашки Петри в термостат вверх дном на 20-24 часа

6. Учет результатов

Степень чувствительности микроба к антибиотику	Диаметр юны отсутствия роста, мм
Чувствительные	>10
Малочувствительные	<10
Устойчивые	Полное отсутствие

Чувствительные микроорганизмы (susceptible). Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.

При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).

27

Резистентные микроорганизмы (resistant). К резистентным (устойчивым) относят

бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.

Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate). Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.

С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.

Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.

В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.

28

2.1.2.Определение антибиотикочувствительности с помощью Е-тестов.

Характеристика метода. Количественный. Определяет активные препараты и их ингибирующие концентрации.  Особенности метода. Используют стандартные пластиковые полоски с нанесенным на них экспоненциально убывающим градиентом концентрации антибиотика, например от 256 до 0,016 мкг/мл. Техника проведения. Готовят суспензию тест-микроорганизмов в концентрации 10⁸ КОЕ/мл, погружают в нее стерильный тампон, равномерно штриховыми движениями распределяют суспензию по поверхности среды Мюллер-Хинтона или АГВ (рН 7,2±0,1), поверхность среды высушивают. На чашку диаметром 90 мм наносят не более 2 полосок E-теста (на чашку диаметром 150 мм  не более 6), инкубируют при 35⁰С 16–18 часов. Принцип учета. Антибиотик из Е-теста центробежно диффундирует в среду, в месте его активного действия рост микроорганизмов подавляется и образуется эллипсоидная (каплевидная) зона задержки роста. Так как концентрация антибиотика в полоске убывает, то получается не концентрическая, а эллипсоидная зона задержки роста. Место пересечения основания эллипса со шкалой концентраций E-теста соответствует МИК антибиотика.

Оценка чувствительности. Ингибиция роста микроорганизма вокруг полоски-носителя происходит только в той зоне, где концентрация антибиотика выше МИК. Определяют МИК тест-культуры и сравнивают со стандартными величинами МИК. Относят тест-культуру к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным.  Оценка метода. Простой, не трудоемкий, позволяет тестировать привередливые микроорганизмы (стрептококки, пневмококки, гемофилы, гонококки, анаэробы). Не получил широкого распространения из-за дороговизны.

29