3. Биологические (биотехнологические) методы «сшивки» компонентов полимеров. Реакционные группы биополимеров, участвующих в сшивке. Физико-химические свойства и применение трансглютаминазы.

Биологическая сшивка - это процесс соединения двух или более биомолекул с помощью сшивающих агентов биологической природы, посредством ковалентной связи. Сшивающие агенты биологической природы содержат два или более реактивных конца, которые способны к химическому присоединению к конкретным функциональным группам (карбоксильным, сульфгидрильным и т.д.) белков или других молекул.

Несмотря на сложность структуры белков, только небольшое количество функциональных групп, входящих в состав белков, практически используется для методов сшивки. В самом деле, только четыре функциональные группы белков определяют подавляющее большинство методов сшивания и химической модификации:

- первичные амины (-NH₂): эта группа находится на N-конце каждой полипептидной цепи (альфа-амины) и в боковой цепи остатков лизина (Lys) (эпсилон-амины). Первичные амины при физиологических условиях имеют положительный заряд и обращены к внешней поверхности белков, поэтому они, как правило, доступны для сопряжения без денатурации структуры белка;

- карбоксильная группа (-СООН): эта группа находится на С-конце каждой полипептидной цепи и в боковых цепях аспарагиновой (Asp) и глутаминовой кислот (Glu). Как и первичные амины, карбоксильная группа, как правило, находится на поверхности структуры белка;

- сульфгидрильная (-SH): эта группа расположена в боковых цепях цистеина (Cys). При образовании вторичной и третичной структуры белка, боковые цепи цистеина соединяются между собой посредством дисульфидных связей (-S-S-);

- карбонилы (-CHO): кетоны и альдегиды могут входить в состав гликопротеинов, которые возможно модифицировать.

Число возможных соединений при сшивании белков и других молекул огромно .

В качестве сшивающих агентов биологической природы используют ферменты, в частности трансглютаминазу.

Трансглютаминаза, согласно международной номенклатуре, относится ко второму классу ферментов - трансферазам. Трансферазы - ферменты, переносящие функциональные группы. Это кальций-зависимые ферменты, которые катализируют образование сшивок между свободными аминогруппами (свободных, либо боковых цепей лизина) и гамма-карбоксамидными группами глутамина (рисунок 1.3.2). Связи, сформированные трансглютаминазами, высоко устойчивы к протеолитической деградации. Эти связи могут быть сформированы между белками, отличающимися по типу (Нр, казеины, миозины, глобулины, актины и т.д.) и по происхождению (из крови, из сои, пшеничной клейковины и т.д). Этот фермент воздействует исключительно на протеины.

Рис. Схема образования связей при действии трансглютаминазы

Трансглютаминаза может быть получена из различных источников:

Микробная трансглютаминаза.

Получают трансглютаминазу методом ферментации, чаще крахмала, бактериями Bacillus subilis GT. Преимуществом микробных трансглютаминаз является то, что они не являются зависимыми от кальция. Возможно использование генетически модифицированных микроорганизмов, однако такие работы ведутся только в лабораторных условиях.

Трансглютаминаза плазмы крови.

Трансглютаминаза плазмы крови может быть извлечена при обработке плазмы крови (например, бычьей крови). Для использования этой формы трансглютаминазы, её нужно активировать тромбином в присутствии ионов кальция.

Трансглютаминаза эритроцитов.

Это фермент найден в красных кровяных клетках (например, в крови свиней).

У млекопитающих были определены на уровне генома восемь различных изоферментов трансглутаминазы, однако только шесть до сих пор были выделены и охарактеризованы на уровне белка, после очистки, либо из природных источников или рекомбинантных белков .

Чтобы улучшить функционирование трансглютаминазы можно применять восстанавливающий агент - dithioreithol (Реагент Клиланда), который разрывает дисульфидные мостики белков, что позволяет раскрыть молекулу и она становится доступной для трансглютаминазы. Добавление этого агента гарантирует, что более связанные места белковых молекул станут более доступны для трансглютаминазы.

Трансглютаминаза может легко окислиться и инактивироваться цистеином группы SH. Поэтому необходимо, чтобы трансглютаминаза была защищена от кислорода воздуха и других окислителей.

Как и все ферменты, активность трансглютаминазы температурною и рН-зависимы.

Свойства трансглютаминазы:

- высокая связывающая способность;

- стабильность в достаточно широком диапазоне значений pH. Значение pH=6 - оптимальное для активности фермента трансглютаминазы, которая эффективно проявляет свои свойства также в диапазоне pH=5,0 - 9,0.

- большой температурный диапазон активности. Температурный оптимум для фермента - порядка 50°С, диапазон активности - от 2 до 55°С. Инактивация трансглютаминазы происходит с разной скоростью в зависимости от температуры. Полная инактивация трансглютаминазы при температуре 72 – 75°С происходит в течение 5-10 мин;

- безопасность. Поскольку трансглютаминаза широко распространена в природе, и люди все время употребляют пищу с поперечными связями, сформированными благодаря трансглютаминазе, использование фермента в пищевых технологиях безопасно для здоровья.