1. Методы секвенирования днк.

Современный этап генетики характеризуется огромными достижениями генетики: генетики человека, медицинская и клиническая генетика значительно продвинулась вперед, особенно за последние 20 – 30 лет.

На основе консолидированных усилий ученых развитых стран мира (США, Англия, Франция, Швеция, Израиль, Япония), предложивших, профинансировавших и полностью реализовавших международную программу «Геном человека» (1988 – 2005), в данной области знаний произошли кардинальные изменения.

Геном человека – международная программа, конечной целью которой является определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) всей геномной ДНК человека, а также идентификация генов и их локализация в геноме (картирование). 

Исходной задачей программы «Генома человека» было создание генетической и физической карт генома человека, которые должны были стать основой расшифровки точной последовательности четырех нуклеотидов всех гигантских молекул ДНК, образующих геном. Для этого были разработаны специальные методы секвенирования ДНК (sequence – последовательность). Первоначально программа была запланирована на 15 лет и ее стоимость оценивалась в 3 млрд долларов. Но серьезные технические и методические усовершенствования позволили автоматизировать процесс секвенирования, сделать его более эффективным, быстрым и экономичным.

Метод Сэнгера (блот-гибридизация) – метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Впервые этот метод секвенирования был предложен Фредериком Сэнгером в 1977 году, за что он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году.

Принцип метода

В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой. Реакцию с одной и той же матрицей проводят в четырёх разных пробирках, каждая из которых содержит:

• праймер – небольшая одноцепочечная молекула ДНК, комплементарная началу участка, который нужно отсеквенировать. Праймер необходим потому, что ДНК-полимеразы не могут начинать синтез цепи «с пустого места», они только присоединяют следующий нуклеотид к уже имеющейся 3'-гидроксильной группе предыдущего. Праймер, таким образом, представляет собой «затравку» при синтезе ДНК;

• небольшое количество радиоактивно меченногодезоксинуклеотида (например, [³²P]-дАТФ), который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции;

• смесь трёх дезоксинуклеотидов в оптимальных для протекания реакции концентрациях, четвёртый дезоксинуклеотид в более низкой концентрации и дидезоксипроизводное четвёртого нуклеотида.

У дидезоксирибонуклеотидов отсутствует 3'-гидроксильная группа, поэтому после их включения в цепь дальнейший синтез обрывается. Таким образом, в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом (в соответствии с добавленным дидезоксинуклеотидом). После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и проводят радиоавтографию гелей. Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК.

Метод Сэнгера позволяет также определять нуклеотидную последовательность РНК, но она предварительно должна быть «переписана» в форме ДНК с помощью обратной транскрипции.

На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано и проводится на специальных приборах, секвенаторах. Использование дидезоксинуклеотидов с флуоресцентными метками с разными длинами волн испускания позволяет проводить реакцию в одной пробирке. Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом в растворе, фрагменты ДНК, выходящие из капиллярной колонки регистируются детектором флуоресценции. Результаты анализируют с помощью компьютера и представляют в виде последовательности разноцветных пиков, соответствующих четырём нуклеотидам. Секвенаторы такого типа могут «прочитывать» за один раз последовательности длиной 500– 1000 нуклеотидов.

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) – метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. в 1993г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.

В результате выполнения программы «Геном человека» было секвенировано около 99% районов с точностью 99,9%. Остается еще менее 400 брешей. В одной молекуле ДНК содержится 3 миллиарда пар нуклеотидов.

Проект генома человека официально завершен 20 апреля 2003 г. исследования генома человека активно продолжаются.

Таким образом, главной целью проекта «Геном человека» было секвенировать все 3 миллиарда пар нуклеотидов в гаплоидном геноме человека и идентифицировать все гены.

Завершение секвенирования генома человека является важной вехой в генетике человека, но это не означает, что мы знаем функции всех этих генов. Анализ тысяч генов в норме и при болезнях будет гораздо более сложным проектом, чем секвенирование генома.