Лабораторная работа № 6

Тема:	Кинетика ферментативных реакций. Ингибиторный анализ
Цель работы:	Определение основных кинетических параметров, ферментативных реакций – константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции. Определение характера ингибирующего действия сульфата меди на скорость реакции расщепления крахмала.

Оборудование и материалы:

• Спектрофотометр Solar PV 1251B

• Кюветы стеклянные

• pH-метр

• Мешалка магнитная

• Якоря магнитные

• Термостат

• Пробирки

• Штативы для пробирок

• Цилиндры мерные на 10 мл и 100 мл

• Стаканы стеклянные градуированные на 10 и 100

• Колбы на 100-250мл

• Стакан на 300 мл

• Автоматические микропипетки

• палочки стеклянные

• Бумага миллиметровая

Реактивы:

• Амилаза бактериальная

• Крахмал, 0.25% раствор

• Ацетилтиохолин йодид

• Ацетилхолин бромид

• Дитиобиснитробензойная кислота

• Бикарбонат натрия

• Гуинидин сульфат

• Раствор Люголя (йод, 1% раствор в KJ, 2,5%)

• Сульфат меди (CuSO₄), 2% раствор

• Хлорид натрия (NaCl), 1% раствор

• Вода дистиллированная

Теоретическое часть

Кинетика ферментативных реакций

Уже в ранних исследованиях по влиянию концентрации реагента на скорость ферментативных реакций была обнаружена очень важная особенность ферментативного катализа, которая заключается в сложном характере кинетики этих реакций. Так, при низких концентрациях реагента (или субстрата) реакция протекает в соответствии с уравнением первого порядка. При высоких концентрациях субстрата скорость перестает зависеть от концентрации и, таким образом, реакция в этих условиях протекает в соответствии с уравнением нулевого порядка. Общий вид зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при такой двухступенчатой кинетике приведен на рис. 6.1. При высоких концентрациях субстрата весь фермент оказывается связанным с субстратом, и скорость реакции будет максимальной. Другими словами, в реакциях, катализируемых ферментами, стадией, определяющей скорость процесса, будет стадия распада комплекса на фермент и продукт.

Рис. 6.1

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Итак, начальная скорость ферментативной реакции, обозначенная на рис. 6.1 символом V₀ (скорость, измеряемая за период, когда израсходована небольшая часть субстрата) увеличивается по мере роста концентрации субстрата в реакционной смеси. При неизменности остальных условий (концентрации фермента [Е], концентрации кофакторов, температуры, значения рН) это увеличение начальной скорости ферментативной реакции, в зависимости от концентрации субстрата происходит до тех пор, пока не наступит состояние насыщения фермента субстратом. Скорость реакции, измеренная в условиях насыщения, уже не зависит от дальнейшего повышения концентрации субстрата. Она достигает максимального значения, называемого максимальной скоростью реакции, V_max, которая далее остается постоянной.

В ферментативной кинетике обычно используют значительный молярный избыток субстрата по сравнению с концентрацией фермента. Например, если фермент с молекулярной массой 100.000 взаимодействует с субстратом с молекулярной массой 100 и оба компонента присутствуют в реакционной смеси в концентрации 1 мг/мл, каждый, то на один моль фермента будет приходиться 1000 молей субстрата. В клетке наиболее реальными являются следующие численные значения концентраций фермента и субстрата: [E] = 0,1 мкг/мл = 10 ^{– 9} М, [S] = 0,1 мг/мл = 10 ^{– 3} М, т.е. молярный избыток субстрата по отношению к ферменту составляет величину, равную 10⁶. Даже при уменьшении [S] в 100 раз, его концентрация все еще будет 10.000-кратно превышать концентрацию фермента.