Лабораторная работа «Изучение скорости почечной диффузии салициловой кислоты через полупроницаемую мембрану (модель)»

Для изучения скорости диффузии ксенобиотика через полупроницаемую мембрану (модель стенки почек) собирается установка, включающая стеклянную трубку большого диаметра, с одного конца покрытую полупроницаемой мембраной, широкий химический стакан (рис. 2)

Рис. 2. Схема установки для изучения токсико-кинетических параметров.

Трубку с раствором ксенобиотика (кровь) и концом, покрытым полупроницаемой мембраной, погружают в химический стакан вместимостью 150 – 200 мл и заполненный 100 мл дистиллированной воды (моча).

Через 0,5 часа из химического стакана отбирают первую пробу раствора (моча) - раствор № 1.

К 5 мл пробы добавляют по 0,2 мл подкисленного до рН 2,0 0,1 моль/л раствора хлорида железа (III). При этом образуются комплексные ионы фиолетового цвета. Далее определяют концентрацию раствора ксенобиотика фотоколориметрическим методом по предварительно построенному калибровочному графику.

Далее пробы отбирают через каждые 30 минут, получая соответственно растворы № 2 - 4.

После каждого отбора проб в химический стакан возвращают отобранный объем, заменяя его дистиллированной водой (5 мл).

По результатам эксперимента строят графики в координатах lnC - t и рассчитывают токсикокинетические параметры: константу элиминации (k_эл) и период полувыведения (t_1/2).

Сделайте вывод о скорости элиминации салициловой кислоты из модельной системы «кровь—почка—моча».

Построение калибровочного графика.

Готовят 0,1 % раствор ксенобиотика и из него путем разведения калибровочные растворы с концентрацией 0,05%, 0,025%, 0,01%, 0,005%, 0,002%, 0,001%.

К 5 мл каждого из калибровочных растворов добавляют по 0,2 мл подкисленного до рН 2,0 0,1 моль/л раствора хлорида железа (III). При этом образуются комплексные ионы фиолетового цвета. Определяют оптическую плотность каждого из растворов на фотоколориметре в диапазоне 380 - 430 нм при максимуме длин волн, который соответствует образовавшемуся комплексу.

Литература

1. Материалы лекций.

2. Токсикологическая химия: Учебник для вузов / Под ред.Т.В. Плетеневой. 2-е изд., испр. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - С.125-144.

3. Токсикология в таблицах и схемах / Келина Н.Ю., Безручкo H.B. - Ростов-н/Д.: Феникс, 2006. - 142 с

Варианты используемых ксенобиотиков.

1. Ацетилсалициловая кислота

2. Салициловая кислота

3. Фенол

4. Резорцин

5. Бензойная кислота

6. Сульфосалициловая кислота ( диапазон 540 – 560 нм)

Часть II. Токсико-кинетические характеристики ксенобиотиков. Токсикокинетика насыщения

Цели и задачи

• освоить метод количественной оценки токсичности некоторых ксенобиотиков по токсико-кинетическим параметрам общеклинических и биохимических показателей крови;

• изучить процесс токсикокинетики ферментативных процессов.

При значительном увеличении дозы ксенобиотика скорость его распределения или элиминации может изменяться в соответствии с кинетикой насыщения. В этих случаях в токсикокинетических моделях насыщения используется уравнение Михаэлиса - Ментена, включающее два параметра (v_max и К_м):

v = (v_max · С_своб)/(К_м + С_своб),

где v_max — максимальная скорость распределения или элиминации; К_м — постоянная Михаэлиса, или концентрация ксенобиотика при скорости, равной половине максимальной; С_своб - концентрация свободного (не связанного с белками или другими рецепторами) ксенобиотика.

При концентрации ксенобиотика в организме, большей К_м, скорости распределения и элиминации перестают быть пропорциональны дозе. Превращения ксенобиотиков, соответствующие кинетике насыщения, подчиняются закономерностям процессов нулевого порядка:

v = dC/dt = k₀C⁰ = k₀.

Таким образом, в этом случае скорость процессов не зависит от концентрации, т.е. представляет собой постоянную величину. При больших концентрациях ксенобиотика (субстрата) практически все молекулы фермента связаны в комплекс. Поэтому дальнейшее увеличение концентрации субстрата практически не увеличивает концентрации комплексов, и, следовательно, скорость реакции остается постоянной.

Выберите один или несколько правильных ответов

1. Токсикокинетика насыщения описывает скорость элиминации ксенобиотика при значительном увеличении его содержания в организме в соответствии с уравнением Михаэлиса—Ментена:

1. v = k₀С⁰ = k₀;

2. t_1/2 = (0,693 · V_d)/Cl;

3. V_d =D_в/в(β·AUC^∞₀);

4. v = (v_max · C_своб)/(K_м + С_своб).

1. В уравнении Михаэлиса-Ментена v_max представляет собой:

1. максимальный объем распределения ксенобиотика в организме;

2. максимальное содержание свободного (не связанного с белками или другими рецепторами) ксенобиотика;

3. максимальную скорость элиминации/распределения;

4. максимальное содержание ксенобиотика при скорости, равной половине максимальной скорости.

1. Для процессов, подчиняющихся кинетике насыщения, скорость не зависит от концентрации и описывается уравнением:

1. V_d = D_в/в /С₀;

2. dC/dt = k₀C⁰ = k⁰;

3. V_d = D_в/в(β · AUC^∞₀);

4. v = (v_max · C_своб)/(K_м + С_своб).

1. Признаки нелинейной токсикокинетики (кинетики насыщения) в отличие от токсикокинетики первого порядка:

1. отсутствие экспоненциального снижения уровня токсиканта в организме;

2. площадь под токсико-кинетической кривой AUC не пропорциональна дозе;

3. значения V_d, C1, k_эл (или β), t_1/2 не изменяются с увеличением дозы;

4. кривые «доза-ответ» отражают непропорциональные изменения ответа при увеличении дозы, начиная с доз, при которых становятся очевидны эффекты насыщения.

1. Биодоступность ксенобиотика - это:

1. степень абсорбции (всасывания) ксенобиотика в кровь при внесосудистом способе введения относительно внутривенного введения;

2. F = [AUC_вн/D_вн ]· [D_в/в/AUC_в/в];

3. F = [AUC_в/в/D_в/в] · [ AUC_вн/D_вн];

4. F = [AUC_в/в/D_вн] · [D_в/в/AUC_вн].

1. На величину биодоступности влияют:

1. ограниченное всасывание ксенобиотика при пероральном приеме;

2. эффект первого прохождения через кишечник;

3. эффект первого прохождения через печень;

4. химическая природа вещества.

1. Полное всасывание ксенобиотика в системный кровоток соответствует:

1. 0 < F < 1;

2. F > 1;

3. F = 1;

4. F < 1.

Семинар «Кинетические характеристики токсикантов различной химической природы. Количественная оценка токсичности циклоспорина по токсико-кинетическим параметрам общеклинических и биохимических показателей крови»

Вопросы для самостоятельной работы.

1. У мужчины средних лет, поступившего в клинику после отравления недоброкачественным напитком, содержащим растворимые соли ртути, содержание ртути в моче изменялось следующим образом:

Время, дни	С, мкг/л	Задание
1	0	Построить кинетические кривые С – t, lnC – t и оценить скорость элиминации токсического элемента по однокамерной токсикокинетической модели. Чему равно время полувыведения токсичного вещества из организма?
2	2
3	8
4	10
10	12
15	13
18	25
20	60
21	100
22	150
30	300

2. У женщины, поступившей в клинику после отравления хлордиазепоксидом, содержание токсиканта в моче изменялось следующим образом:

Время, дни	С, мкг/л	Задание
0,1	0,0025	Построить кинетические кривые С – t, lnC – t и оценить скорость элиминации токсического элемента по однокамерной токсикокинетической модели. Чему равно время полувыведения токсичного вещества из организма?
0,5	0,12
1	0,25
1,5	0,5
2	1,0
4	2,0
8	3,0
12	60
24	100
36	150
48	300

3. У ребенка, поступившего в клинику после отравления димедролом, содержание токсиканта в крови изменялось следующим образом:

Время, дни	С, мкг/л	Задание
0,1	300	Построить кинетические кривые С – t, lnC – t и оценить скорость элиминации токсического элемента по однокамерной токсикокинетической модели. Чему равно время полувыведения токсичного вещества из организма?
0,5	150
1	100
1,5	60
2	3
4	2
8	1
12	0,5
24	0,25
36	0,12
48	0,0025

4. Элиминация этанола происходит по кинетике насыщения (кинетике нулевого порядка). Определите период полувыведения этанола из организма, если его концентрация в крови изменялась следующим образом:

Время, мин	С, ммоль/кг
60	18
90	16
120	14

5. Содержание диазепама в крови мужчины 48 лет после перорального однократного приема препарата значительно превышает терапевтическую концентрацию 105 ммоль/л и составляет 1050 ммоль/л. Изменение токсиканта в крови происходило следующим образом:

Время, ч	lgС	Задание
1	1,5	Построить кинетические кривые С – t, lnC – t и оценить скорость элиминации токсического элемента по однокамерной токсикокинетической модели. Чему равно время полувыведения токсичного вещества из организма?
2	1,0
3	0,72
4	0,21
5	0,10