Строение ферментов

Ферменты, как вещества белковой природы, делятся на простые и сложные, или, как их еще называют, ферменты-протеины и ферменты-протеиды.

Ферменты-протеины состоят только из аминокислот. У большинства из них в молекулу входит одна полипептидная цепь, имеющая характерную вторичную структуру в виде α- и β-спиралей (иногда они обладают третичной и четвертичной структурой). По химическим свойствам простые ферменты относят к альбуминам, глобулинам и другим группам простых белков.

Ферменты-протеиды состоят из двух частей: термолабильной бел-ковой и термостабильной небелковой. Белковая часть сложного фермента называется апоферментом, небелковая — кофактором. Комплекс кофактора с апоферментом называется холоферментом. Связи между апоферментом и кофактором в молекулах сложных ферментон неодинаковы. Во многих случаях кофакторы непрочно связаны с апоферментом, соединяются с ним только во время ферментативной реакции и легко отделяются в процессе диализа. В этом случае кофактор называют коферментом. Некоторые кофакторы связаны с апоферментом очень прочной ковалентной связью. Такой кофактор обычно называют простетической группой. Однако проводить четкую грань между коферментом и простетической группой нельзя, поскольку в составе одного фермента-протеида кофактор может быть прочно связан с апоферментом, в составе другого — слабо, следовательно, такое деление является условным.

Следует особо подчеркнуть, что апофермент каталитической активностью не обладает, кофактор обладает очень слабой активностью. Полноценный фермент, или активный катализатор, образуется только в результате соединения кофермента с апоферментом. При этом специфические свойства фермента и скорость реакции обусловливаются только белковой частью, а превращение субстрата, перенос атомов. электронов, различных функциональных групп осуществляются коферментом. Как правило, в роли коферментов выступают витамины и их производные (см.. гл. 18). Кроме витаминов роль коферментов выполняют также ионы некоторых металлов (Cu²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Мn²⁺ и др.). Функции коферментов разнообразны. Главной из них, как будет показано ниже, является формирование так называемого активного центра фeрмента и осуществление контакта молекулы фермента с молекулой субстрата. Кроме того, коферменты участвуют в переносе электронов, протонов, атомов, аминных группировок в процессе реакций, а также выполняют связывающую функцию между отдельными ферментами, обеспечивая тем самым согласованность их действия. Рассмотрим наиболее важные кофакторы ферментов-протеидов, выступающие в роли коферментов.

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) состоит из двух мононуклеотидов, соединенных между собой пирофос-фатной связью. В состав одного мононуклеотида входит азотистое. основание аденин, в составе другого азотистым основанием является амид никотиновой кислоты (водорастворимый витамин РР):

Hикотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ). Этот кофермент также является динуклеотидом, однако со-держит в своем составе еще один остаток фосфорной кислоты, соединенный эфирной связью со вторым атомом углерода рибозы адениловой кислоты:

НАД и НАДФ входят в состав так называемых дегидрогеназ — ферментов, осуществляющих окисление субстратов путем отщепления атомов водорода и электронов.

Флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинаде-ниндинуклеотид (ФАД) содержат в своем составе рибофлавин (витамин В₂):

ФМН и ФАД входят в состав дегидрогеназ.

Убихинон был впервые описан английским ученым Р.К.Мор-тоном, который и дал ему это название, что в переводе означает «вездесущий хинон», поскольку он встречается почти во всех клетках. Убихинон имеет следующее строение:

Этот кофермент способен обратимо присоединять атомы водорода. Коферменты — порфириновые комплексы. Порфириновые комплексы являются составной частью ряда окислительно-восстановительных ферментов, осуществляющих перенос электронов, в частности цитохромов. Активной частью этих ферментов является железопорфириновый комплекс. Наиболее изученным кофер-ментом порфириновой группы является цитохром с.

Специализированные центры ферментов. Молекулы ферментов имеют большие размеры (обычно больше, чем субстрата) и сложную пространственную конфигурацию. В молекуле фермента различают три специализированных центра: активный, субстратсвязывающий и аллостерический. При этом каждая часть молекулы строго специализирована, т.е. выполняет свою определенную роль.

Активный центр — это динамическое образование. У простых ферментов он представляет собой уникальное объединение остатков определенных аминокислот, которые размещены в различных местах полипептидной цепи молекулы белка. Такими остатками являются радикалы гистидина, серина, аргинина, триптофана, цистеина, тирозина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. В молекулах простых ферментов активный центр возникает в результате того, что полипептидная цепь молекулы белка принимает такую конфигурацию, при которой радикалы указанных выше аминокислот оказываются рядом. Образуется как бы своеобразный «карман», в котором происходят каталитические превращения субстрата. Такой конфигурацией, как правило, является третичная структура полипептидной цепи. Таким образом, активный центр ферментов-протеинов возникает в этот момент, когда белковая молекула приобретает характерную для нее третичную структуру. Поэтому изменение этой структуры может вызвать деформацию или разрушение активного центра и ослабление ферментативной активности.

У сложных ферментов роль активного центра выполняет его небелковая часть, т.е. кофактор, а также прилегающие к нему белковые функциональные группы: HS—цистеина, ОН—серина, СООН—аспарагиновой и глутаминовой кислот, имидазольное кольцо гистидина и др.

Активный центр, образованный радикалами определенных аминокислот или кофактором, характеризуется строгой геометрической конфигурацией. В связи с этим данный фермент может оказывать свое каталитическое действие на субстрат, находящийся в точном геометрическом соответствии со структурой активного центра, подобно тому, как ключ подходит к замку.

Соответствием строения активного центра фермента и субстрата объясняется высокая специфичность ферментов. Только субстрат определенного строения может войти в тесное соприкосновение с активнным центром фермента.

В молекулах ферментов различают также специализированные участки, отвечающие за связь с субстратом. Их называют субстратсвязывающим (субстратным) центром, или «якорной» площадкой. Как установлено в настоящее время, прикрепление субстрата к этому участку одних ферментов происходит в результате взаимодействия субстрата с ε-аминогруппой аминокислоты лизина, у других — с участком свободной СООН-группы глутаминовой кислоты и HS-группы цистеина, которые расположены, как правило, в субстратном центре молекулы фермента.

Проводить четкую границу между активным и субстратным центром, однако, нельзя, поскольку в природных ферментах субстратный центр может совпадать или перекрываться с активным. Представление о наличии в молекулах белков определенных участков помогает лучше понять каталитическую функцию ферментов. В молекулах ферментов есть также участки, расположенные на некотором удалении от активного и субстратного центров. Их называют аллостерическими, или регуляторными, центрами. К этим центрам могут присоединяться различного рода вещества, вызывая при этом изменение пространственной конфигурации молекулы фермента. Как следствие этого происходит изменение конфигурации и активного центра, что сопровождается увеличением или уменьшением каталитической активности фермента. Через аллостерический центр на активность фермента могут влиять различные регуляторные факторы, в качестве которых выступают продукты ферментативных реакций, гормоны и продукты их обмена, медиаторы нервной системы и др. Регуляторные факторы, повышающие активность ферментов, называют аллостерическими активаторами, уменьшающие ее — аллостерическими ингибиторами.

В настоящее время обнаружено десятки ферментов, обладающих аллостерическими центрами. Такие ферменты называют аллостерическими, или регуляторными, т.е. ферментами, активность которых регулируется. В полиферментных системах регуляторные ферменты, как правило, первыми начинают каталитическое превращение субстрата и прекращают свое действие под влиянием конечного продукта ферментативных реакций. В этом случае регулируемое влияние на активность аллостерического фермента конечным продуктом называется принципом обратной связи. Этот принцип лежит в основе мо-лекулярной саморегуляции большинства ферментативных процессов (биосинтеза белка, гликогена, окисления углеводов и т.д.).

Классификация и номенклатура ферментов

Высокая специфичность действия ферментов обусловливает очень большое их количество. Почти каждая реакция, протекающая в живом организме, осуществляется с участием специфически приспособленного к ней фермента или группы ферментов. В настоящее время известно около 2000 различных ферментов и число их продолжает увеличиваться.

В 1961 г. в Москве на V Международном биохимическом конгрессе была утверждена единая классификация и номенклатура ферментов. В основу классификации был положен принцип разделения всех фер-ментов в соответствии с типом химических реакций, которые они ката-лизируют. В связи с этим все известные реакции, протекающие в ор-ганизме, были разделены на шесть основных типов:

1. Окислительно-восстановительные реакции.

2. Процессы переноса отдельных групп от одних субстратов к другим.

3. Реакции расщепления субстратов с участием воды (гидролиз),

4. Процессы отщепления каких-либо групп с образованием двой-ных связей без участия воды.

5. Реакции, при которых одни вещества превращаются в другие при неизменном количестве атомов (процессы изомеризации).

6. Синтетические процессы, в результате которых образуются новые вещества, с использованием энергии АТФ.

В соответствии с шестью типами химических реакций все известные ферменты делятся на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы. 2. Трансферазы. 3. Гидролазы. 4. Лиазы 5. Изомеразы. 6. Лигазы (синтетазы). Кроме того, каждый класс под-разделяется на подклассы, которые, в свою очередь, делятся на под-подклассы, состоящие из отдельных представителей. Таким образом, каждый фермент имеет четырехзначный шифр, или код, в котором первая цифра обозначает класс, к которому относится данный фермент, вторая цифра — подкласс фермента в этом классе, третья — подпод-класс, четвертая — порядковый номер фермента в данном подподклассе. В начале шифра ставится две буквы— КФ (классификация-ферментов).

В соответствии с новой номенклатурой названия ферментов со-состоят из двух частей. Первая часть указывает на название субстрата, вторая — на природу химической реакции, осуществляемую фермен-том, с прибавлением суффикса -аза. Если фермент катализирует реакцию между двумя субстратами, то в первой части названия ферментa дают названия обоих субстратов, разделенные двумя точ-ками, в другой — указывают тип химической реакции с добавлением суффикca -аза.

Таким образом, согласно принятой классификации и номенклату-ре ферментов, в названии фермента отражается тип химической реакции, которую они катализируют, а сам фермент имеет свой шифр, который ставится после названия фермента в скобках.

Рассмотрим на примерах названия и шифры некоторых ферментов. I. Оксидоредуктазы — ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, т.е. перенос электронов и атомов водо-рода от одного вещества (донатора) к другому (акцептору). В резуль-тате реакций, катализируемых оксидоредуктазами, клетки получают химическую энергию.

Оксидоредуктазы являются сложными ферментами. В качестве кофакторов в их составе могут быть никотинамидные коферменты (НАД и НАДФ), флавиннуклеотиды (ФМН и ФАД), железопорфири-новые комплексы (гем) и многие катионы (Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ и др.). Перечисленные кофакторы способны выполнять роль ацепторов элек-тронов и атомов водорода и передавать их другим веществам. Название ферментов строится по такой общей схеме: Донатop: акцептор —оксидоредуктаза.

Наряду с этим применяется также рабочая номенклатура оксидо-редуктаз, в основе которой лежит название акцептора электронов и водорода. Так, если акцептором является кислород или пероксид водо-рода, такие оксидоредуктазы называют соответственно оксидазами и пероксидазами. Оксидоредуктазы, передающие электроны и водо-род на какой-либо другой акцептор, кроме кислорода и пероксида водорода, называют дегидрогеназами. Таких оксидоредуктаз подавляющее большинство.

В классе оксидоредуктаз есть целый ряд подклассов и подподклассов (в шифpe ферментов это соответственно вторая и третья цифры).

В подклассе оксидоредуктаз отражены окисляющиеся группы веществ (т.е. донаторы электронов и атомов водорода), каждая из которых имеет свой определенный порядковый номер. Например, цифрой 1 всегда обозначается спиртовая ОН-группа, цифрой 2 — альдегидная или кетонная группа. Подподкласс в рассматриваемом классе обозначает акцепторы электронов и атомов водорода (это не что иное, как кофакторы оксидоредуктаз), которые, так же как и донаторы (окисляемые группы), имеют свои определенные номера. Цифра 1 в подподклас-се, например, обозначает, что акцептором электронов и водорода являются никотинамидные коферменты (НАД и НАДФ).

Например, фермент спиртового брожения алкогольдегидрогеназа согласно номенклатуре называется так: алкоголь: НАД — оксидоре-дуктазй (КФ 1.1.1.1). Первая цифра шифра показывает принадлежность фермента к классу оксидоредуктаз; вторая — к подклассу окси-доредуктаз, которые окисляют спиртовые группы; третья — к подподклассу оксидоредуктаз, кофактором которых является НАД; четвертая — порядковый номер фермента в подклассе. Перечень под-классов, подподклассов и порядковых номеров для любого класса представлен в специальном справочнике по номенклатуре ферментов.

2. Трансферазы — класс ферментов, катализирующих перенос определенных химических групп от одного вещества (донатора) к дру-гому (акцептору). Название фермента создается по схеме: донатор: акцептор — группа-трансфераза. Например, систематическое назва-ние фермента гексокиназы записывается так: АТФ: D-гексозо-6-фосфо-трансфераза (КФ 2.7.1.1). Это означает, что фермент принадлежит ко второму классу (трансфераз), седьмому подклассу (переносит фосфат-ные группы), к первому подподклассу (акцептором являются вещества со спиртовой группой, в данном случае гексоза) и порядковый номер фермента в подподклассе — первый.

Класс трансфераз принимает участие в обмене белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот и насчитывает около 800 ферментов.

3. Гидролазы — ферменты, катализирующие реакции расщепле-ния веществ с участием воды. Каталитическая активность этих фермен-тов зависит от наличия в их каталитическом центре HS-гpyпп. В со-ответствии с систематической номенклатурой названия гидролаз составляются по схеме: субстрат—гидролаза. Например, фермент АТФаза называется АТФ — фосфогидролазой (КФ 3.6.1.3). Он от-носится к третьему классу (гидролазы), шестому подклассу (расщеп-ляет кисло-ангидридные связи), первому подподклассу (эти cвязи находятся в молекуле АТФ), порядковый номер данного фермента в подподклассе — третий.

Гидролазы широко распространены в природе и участвуют в об-мене углеводов, жиров, белков и других соединений.

4. Лиазы — ферменты, катализирующие реакции негидролитиче-ского отщепления определенных групп с образованием двойных свя-зей или присоединения групп по двойным связям. Эти реакции осуще-ствляются без использования энергии макроэргических соединений. Систематические названия ферментов этого класса строятся так же, как и названия гидролаз, т.е. по схеме субстрат — отщепляемая rpуп-па-лиаза. Например, аспартат — аммиак-лиаза по систематической номенклатуре называется L-аспартат — аммиак-лиаза (КФ 4.3.1.1). Это значит, что фермент принадлежит к четвертому классу (лиаз), третьему подклассу (катализирует, разрыв связи между атомами угле-

рода и азота), к первому подподклассу (отщепляет аминогруппу), а порядковый номер его в подподклассе—первый. Лиазы, как правило,— сложные ферменты, содержащие в качестве

кофакторов фосфорные эфиры водорастворимых витаминов.

5. Изомеразы — ферменты, которые катализируют реакции внут-

римолекулярного перемещения различных групп или реакции образо-вания изомеров. Типичным примером ферментов этого класса явля-ется триозофосфатизомераза, систематическое название которой — D-глицеральдегид-3-фосфат—кетол-изомераза (КФ 5.3.1.1). Дан-ный фермент обратимо превращает 3-фосфоглицериновый альдегид в диоксиацетонфосфат.

6. Лигазы (синтетазы) — ферменты, с участием которых осуществляется присоединение друг к другу двух молекул с использованием энергии АТФ и образованием новых связей. Лигазы называют еще

синтетазазами, поскольку они являются катализаторами синтетических реакций. Это сложные ферменты. Кофактором многих из них явля-ется витамин Н, или биотин. Наиболее изученными ферментами этого класса являются карбоксилазы, например ацетил-КоА — карбоксила-за, систематическое название—ацетил-КоА: СО₂ — лигаза (АДФ) (КФ 6.4.1.2). Фермент катализирует образование так называемого молонил-КоА—промежуточного соединения в биосинтезе высших жирных кислот из ацетил-КоА и угольной кислоты.

Внутриклеточная локализация ферментов

Подавляющее большинство ферментов действует внутри клетки, где они образовались, т.е. представляют собой так называемые эндо-ферменты. При этом для них характерна определенная клеточная локализация.

В общей форме локализацию важнейших групп ферментов внутри клетки можно представить следующим образом. В жидкой части клетки в виде отдельных молекул находятся многие важные группы ферментов: ферменты, катализирующие процессы анаэробного дыхания или спиртового брожения, превращение Сахаров, расщепление крахмала α- и β-амилазы. В той же фазе локализованы все ферменты синтеза высших жирных кислот, многие ферменты, катализирующие синтез и взаимные превращения аминокислот, а также многочисленные гидролитические ферменты.

Ряд ферментов локализован в органеллах клетки — ядре, мито-хондриях, рибосомах и т.д. В ядре в основном находятся ферменты, катализирующие образование нуклеиновых кислот. Все ферменты

и кофакторы дыхательной цепи, а также все ферменты окислительного фосфорилирования, связанные с образованием АТФ в клетке, локали-зованы в митохондриях. Здесь же содержится полный набор фермен-тов, катализирующих реакции цикла трикарбоновых кислот, а также ферменты, катализирующие окисление жирных кислот. Кроме того, в митохондриях локализованы многие аминотрансферазы, катализирую-щие реакции переаминирования, и такой ключевой фермент азотистого обмена - глутаматдегидрогеназа.

Ферменты биосинтеза белка сосредоточены главным образом в рибосо-мах. В них содержатся также ферменты, катализирующие биосинтез рибонуклеиновых кислот.

Биохимические процессы, протекающие в клетке, представляют собой сложные цепи реакций, последовательно катализируемые несколькими ферментами. Многие ферменты в клетке действуют одновременно. При этом вещество, полученное под действием первого фермента, является субстратом для следующего и т.д. Образуются так называемые мультиферментные системы.

По степени сложности мультиферментные системы можно разде-лить на три группы. К первой группе относятся системы, в которых отдельные ферменты находятся в цитоплазме и не связаны друг с дру-гом. В этих случаях молекулы субстратов диффундируют от одного фермента к другому и т.д. , причем продукт действия одного фермента является субстратом для другого (рис. 41, а).

Ко второй группе относятся системы, образованные в виде комплек-сов и с трудом распадающиеся на отдельные ферменты. При этом про-дукт действия одного фермента также является субстратом для другого, однако промежуточные продукты уже не покидают ферментного ком-плекса в результате диффузии (рис. 41, б). Примером такой системы может служить комплекс ферментов, катализирующих синтез жирных кислот или окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты.

Наиболее высокоорганизованными мультиферментными системами являются комплексы ферментов, которые связаны с мембранами кле-точных органелл. Примером такой системы может служить цепь дыха-тельных ферментов, прочно связанных мембраной митохондрий. Ве-щества, подвергающиеся превращению, последовательно пepeдвига-ются вдоль цепи ферментов (рис. 41, в).

Рис. 41. Основные группы мультиферментных систем: а — растворимая система; 6 — мультиферментный комплекс; в — мультиферментная система, связанная с мембраной; А, Б, В, Г, Д — субстраты и промежуточные продукты; Е₁, Е₂, Е₃, Е₄,Е₅ — отдельные ферменты.

В таких системах скорость ферментативных реакций очень высо-кая, поскольку не затрачивается время на перемещение субстратов от одного фермента к другому.

Практическое использование ферментов

Ферменты широко используются в народном хозяйстве. Так, в хлебопечении применяют ферментные препараты, которые улучшают качество и аромат хлеба. При хранении мяса, фруктовых соков, непастеризованных пива и вина как антиокислитель используется глюкозооксидаза. В кожевенном и меховом производстве применяются препараты пептидогидролаз, ускоряющих размягчение шкур и удаление с них шерсти в несколько раз.

Многие ферменты применяются с терапевтической целью. Так, препарат трипсина вместе с антибиотиками используется при лечении хронических язв конечностей и фурункулов. Панкреатическая

ДНКаза применяется при лечении некоторых респираторных заболеваний, гиалуронидаза — для ускорения всасывания различных лекарств, вводимых подкожно. Для разрушения тромбов часто применяют фибринолизин. Аспарагиназа, расщепляющая аспарагин, необходимый для синтеза белков раковыми клетками, применяется при лечении злокачественных опухолей.

По мнению ученых, на смену эре антибиотиков и гормональных препаратов приходит эра ферментов. Однако широкое использование ферментов ограничено их малой стабильностью при хранении, быстрой инактивацией под воздействием внутренних сред организма, сильными иммунологическими реакциями, высокой стоимостью и неспособностью к регенерации. Поэтому уже в настоящее время значительное количество ферментов применяются не в свободном виде, а закрепленными на органических и неорганических носителях. Такого рода системы называют иммобилизованными ферментами. Иммобилизация ферментов, как правило, повышает их стабильность при хранении, устойчивость к температурным изменениям, денатурирующим агентам, действию микроорганизмов. Часто у ферментов, подвергшихся иммобилизации, изменяется специфичность к субстрату. При расщеплении субстратов иммобилизованные ферменты могут давать другие продукты, чем те же ферменты» находящиеся в растворе. В ряде случаев появляется особая субстратная специфичность. Таким образом, благодаря иммобилизации ферментов, т.е. связыванию их с неорганическими или органическими носителями, в значительной степени

устраняются ряд недостатков, которые ограничивают их применение. Иммобилизованные ферменты широко используются для диагностики и лечения различных заболеваний, а также для создания более совершенных протезов и аппаратов, заменяющих работу важнейших органов человека. Методы иммобилизации ферментов открывают принципиально новые подходы в конструировании аппаратов «искусственная почка» и «искусственная печень». Так, на основе иммобилизованной уреазы созданы и прошли успешные испытания портативные аппараты «искусственная почка».

В практической медицине применяются различные типы повязок и тампонов с иммобилизованными на их поверхности ферментами. С применением иммобилизованных ферментов разработаны более точные и экономичные методы массовых клинических анализов для определения глюкозы, молочной кислоты и инсулина в крови, мочевины в сыворотке крови, лактозы в моче, пенициллина в фармацевтических препаратах.

В качестве примера иммобилизованных ферментов можно привести уреазу, используемую для определения мочевины в биологических жидкостях. Иммобилизованная уреаза может «работать» непрерывно в течение четырех месяцев, а храниться без потери активности — в течение трех месяцев при температуре от 0 до 5 °С. Иммобилизованная на нейлоне уратоксидаза позволяет определять мочевую кислоту с точностью до 10^-5—10^-4 моль. Система иммобилизованных ферментов для

определения пировиноградной и щавелево-уксусной кислот обладает большой стабильностью для проведения 800—1000 анализов, тогда как ферменты в растворе за тот же период времени теряют активность на 90 %.

Иммобилизованные ферменты постепенно внедряются также в практику для оценки загрязнения окружающей среды токсическими веществами.