Бактериологический метод диагностики инфикционных заболеваний

I ЭТАП ПОСЕВ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

I I ЭТАП ИЗУЧЕНИЕ РОСТА БАКТЕРИЙ НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Культуральные свойства (описание колоний или характера роста на жидких средах)

Морфологические и тинкториальные свойства (мазок, окраска по Граму)

Определение подвижности бактерий в препарате "раздавленная капля"

Посев материала колоний на скошенный агар для выделения чистой культуры бактерий

I II ЭТАП ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ

1. Культуральные свойства-характер роста на скошенном агаре

2. Морфологические и тинкториальные свойства, проверка чистоты культуры

3. Биохимические свойства

4. Чувствительность к бактериофагу

5. Антигенные свойства (сероидентификация)

6. Патогенность для животных

ЗАКЛЮЧЕНИЕ О ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЕ БАКТЕРИЙ (вид; серо-, фаго-, боивар); ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ (по требованию врача)

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 6. Дата___________________

ТЕМА: БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ. ДЫХАНИЕ БАКТЕРИЙ. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор 3-го этапа бактериологического метода диагностики.

2. Освоение методов определения чистоты выделенной культуры и идентификация ее по морфологическим, культуральным свойствам.

3. Ферменты бактерий: классификация, питательные среды, практическое значение знаний о ферментах бактерий.

4. Методы изучения ферментативной деятельности бактерии.

5. Знакомство с механизмами и типами питания.

6. Разбор методов и сред для культивирования анаэробных бактерий.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. Просмотреть и зарисовать следующие демонстрации:

а) стерильные и измененные среды «пестрого» ряда (записать среды по группам ферментов: сахаролитические, протеолитические, редуктазы);

Для изучения сахаролитических ферментов

Среды Гиса стерильные

жидкие полужидкие

Среды Гиса измененные

жидкие полужидкие

Для изучения протеолитических и пептолитических ферментов

Стерильные индол Измененные индол

сероводород сероводород

Желатин МПБ Желатин МПБ

Для изучения редуктаз (ср. Вильсона-Блера)

с терильная измененная

б) среды первичного отбора колоний: дифференциально-диагностические среды (ср. Эндо, ср. Левина) для определения лактозопозитивных и лактозонегативных колоний микроорганизмов;

среда Эндо среда Левина

в) учесть результаты биохимической активности бактерий по готовым «пестрым» рядам. Пользуясь таблицей провести идентификацию выделенной культуры по биохимическим свойствам;

индол

сероводород

лактоза глюкоза мальтоза манит сахароза МПБ

Вывод:_______________________________

г) среды для культивирования умеренных анаэробов: среда Китта-Тароцци, среда Вильсона-Блера, сахарный МПА, молоко.

Стерильные

ср. Китта-Тароцци ср. Вильсона-Блера сахарный МПА молоко

Измененные

ср. Китта-Тароцци ср. Вильсона-Блера сахарный МПА молоко

2. Выполнение 3-го этапа «Бактериологического метода диагностики» - идентификация выделенной чистой культуры:

а) описать характер роста выделенной культуры на скошенном агаре, обратить внимание на однородность роста (изучение культуральных свойств);

б) определить морфологические и тинкториальные свойства культуры бактерий в мазке, окрашенном по Граму, проверить чистоту выделенной культуры (зарисовать);

в) провести посев выделенной чистой культуры на среды «пестрого» ряда для определения биохимических свойств чистой культуры (высевать только чистые культуры);

г) определить фаголизабельные свойства выделенной чистой культуры, для этого имеются 2 пробирки со стерильным МПБ, которые обозначены «О» и «К», в них засевают выделенную культуру, затем в «О» пробирку стерильной пипеткой вносят соответствующий фаг, в зависимости от вида выделенной культуры.

О К

Учет результатов на следующем занятие.

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ.

Классификация ферментов:

1. Биохимическая: оксиредуктазы, трансферазы, лиазы, гидролазы, изомеразы, лигазы.

2. В зависимости от локализации: а) эндоферменты – локализуются в клетке в цитоплазме или в периплазматическом пространстве, либо связаны с структурами клетки;

б) экзоферменты – выделяются в окружающую среду.

3. В зависимости от постоянства синтеза: а) конституитивные – синтезируются постоянной скоростью и присутствуют в клетке всегда в постоянных концентрациях.

б) индуцибельные – их концентрация резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия субстрата во внешней среде.

4. В зависимости от субстрата: сахаролитические, протеолитические, липолитические.

О ферментативной активности микроорганизма судят по появлению в среде промежуточного или конечного продукта расщепления веществ, которые определяют при помощи индикаторов, добавляемых в питательную среду до посева или индикатор, может быть использован в работе с выросшей микробной культурой.

Изучение биохимических свойств:

1. Для определения сахаролитических ферментов используют «пестрый ряд», который может быть представлен жидкими и полужидкими средами (среды Гисса). Состав среды: жидкая – 1% пептонная вода, углевод, поплавок (для определения газа), индикатор; полужидкая – 0,5% агар-агара, углевод, индикатор.

В качестве индикатора используют: реактив Андреде или ВР (водноголубой и розоловая кислота).

При расщепление углевода до КГ – происходит изменение цвета (К) и разрыв столбика (Г) – полужидкие, всплытие поплавка (Г) – жидкие.

При расщепление углевода до К – происходит только изменение цвета (К), при образовании К реактив Андреде окрашивает питательную среду в красный цвет, индикатор ВР в зелено-синий.

2. Для определения протеолитических ферментов проводят посев в столбик 10-20%

желатина (при + реакции – разжижение желатина), пептонную воду, в которой определяют продукты расщепления пептона: аммиак, индол, сероводород – для каждого из которых имеется индикаторная бумажка, пропитанная определенным индикатором. Аммиак – лакмусовая бумага (при + реакции – посинение), индол – щавелевокислый натрий (при + реакции – розовое окрашивание), сероводород – уксуснокислый свинец (при + реакции – почернение).

АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ – это микроорганизмы, которые утрачивают способность к росту в присутствие воздуха или молекулярного кислорода. Они делятся между собой по чувствительности к кислороду.

1. Облигатные (растут лишь в анаэробных условиях) делятся на умеренные (содержание кислорода 7-8%) и строгие (содержание кислорода 0,5 - 4%). Таким образом, строгие облигатные анаэробы очень быстро гибнут в воздушной среде, в то время как умеренные облигатные анаэробы более устойчивы к кислороду, однако для своего роста требуют условий, исключающих присутствие высоких концентраций кислорода. Большинство клинически значимых анаэробов относятся к группе умеренных облигатных анаэробов.

2. Факультативные (растут как в присутствии, так и в отсутствии кислорода).

Существует много теорий объясняющих причины токсического действия кислорода на анаэробы. Летальность действия кислорода на анаэробы обусловлена образованием токсических продуктов при взаимодействии кислорода с компонентами клеток анаэробов (напр. флавопротеинами) или с компонентами питательных сред. Действительно, восстановление кислорода связано с образованием токсических продуктов, таких как перекись водорода, супероксид анион, атомарный кислород, гидроксил радикал и все существующие микроорганизмы имеют набор ферментов, защищающих их от этих метаболитов. Многие авторы отмечают прямую корреляцию между дефицитом этих ферментов у микроорганизмов и токсичностью для них кислорода. Например, определяется корреляция между уровнем супероксид дисмутазы (фермент, расщепляющий супероксид анион) и толерантностью микробов к кислороду, т. е. чрезвычайно чувствительные к кислороду культуры имели низкий или почти не определяемый уровень этого фермента.

Другие представления: для роста анаэробных бактерий важно поддержание низкого окси-редокс потенциала, т.к. он необходим для поддержания ферментов в активном состоянии, что способствует их росту.

Таким образом, не существует единой теории объясняющей механизм токсического действия кислорода на анаэробные бактерии.

В основе культивирования анаэробов 4 принципа:

1. Правильный сбор и транспортировка проб.

2. Посев на питательные среды как можно скорее после сбора материала и культивирование в оптимальных условиях.

3. Применение ответствующих питательных сред.

4. Инкубация в соответствующих анаэробных условиях.

Лучшими пробами для обнаружения анаэробов являются аспираты и тканевые биоптаты.

Забор и доставка материала осуществляется одним из следующих способов:

- жидкий исследуемый материал набирают в шприц, вытесняют воздух, иглу затыкают пробкой для создания анаэробных условий.

- забор осуществляют стерильным тампоном, пропитанным лизированной кровью донора (10% кровь + 10% глицерин + 80% физ. раствор).

- фрагменты ткани помещают во флакон со смесью 10% кровь +90% физ. раствор.

Для транспортировки маленьких кусочков ткани и аспирационной жидкости используются анаэробные транспортные системы. В крупных биоптатах анаэробы могут сохранять жизнеспособность в течение нескольких часов, поэтому эти пробы могут быть доставлены в стерильной посуде. Взятые иглами и шприцами аспираты абсцессов должны быть сразу доставлены в лабораторию. В специальных транспортных системах есть тампон, соединенный с кольцом. При взятии пробы кольцо ввинчивается во внутрь, при этом разрывается перемычка туба и тампон выдвигается. После забора материала движением кольца назад тампон помещают в транспортную среду. Если работа с пробами не может начаться сразу, пробы должны сохраняться при комнатной температуре.

Исследование нативного материала (микроскопия) очень важно, т.к. можно поставить предварительный диагноз на ранних стадиях исследования. Различные виды анаэробных бактерий при нативной микроскопии имеют характерную для них морфологическую форму. Также в клиническом материале можно обнаружить споры (редко).

Среды для культивирования умеренных анаэробов:

– среда Китта – Тароцци (МПБ, глюкоза, кусочки печени или фарша);

– среда Вильсона – Блера (железосульфитный агар) (МПА, глюкоза, сульфит натрия, хлорид железа);

– высокий столбик сахарного агара;

– молоко.

В этих средах создаются относительно анаэробные условия, поэтому культивирование умеренных анаэробов не требует применения дополнительных методов.

Среды для культивирования строгих анаэробов:

– плотная или жидкая среда КАБ (МПА или МПБ, твин 80, крахмал, цистеин, тиогликоль, гемин);

– тиогликолевые среды с добавлением гемина или витамина К и др.

Методы культивирования анаэробов: инкубация анаэробов должна проводиться в условиях, исключающих доступ кислорода. К анаэробным системам относятся анаэростаты,анаэробные цилиндры, с системой Gaz Pak, перчаточные боксы.

1. В анаэростатах соответствующие условия создаются с помощью эвакуационно-заместительной системы. Через вентиль в крышке откачивается воздух и заполняют смесью газов ( 10% водорода, 5% углекислого газа, 85% азота). Анаэробные условия создаются также с помощью специальной катализаторной системы, приводящей к соединению водорода и кислорода с образованием воды.

2. Современные цилиндры системы Gaz Pak – это цилиндрический пластиковый поликарбонатный сосуд, закрытый воздухонепроницаемой крышкой, на внутренней поверхности которой помещается палладиевый катализатор, а в самом цилиндре имеется газогенераторный конверт. Анаэробные условия создаются через 100 минут. После каждого использования катализатор восстанавливается путем нагревания в течении 2-х часов при 160С, т.к. накопление влаги и сероводорода реактивирует его. Газогенераторные конверты системы содержат две таблетки: одна - с лимонной кислотой и бикарбонатом натрия, другая – содержит хлорид кобальта. После отрезания угла конверта и добавления воды система активируется, в результате образуется углекислый газ, который стимулирует рост анаэробов и водород, который в присутствие катализатора соединяется с кислородом с образованием воды.

3. Анаэробные камеры или перчаточные боксы представляют собой гибкие виниловые коробки и камеры, предназначенные не только для выращивания культур, но и для работы с ними при идентификации. Внутри бокса находится трехкомпонентная газовая смесь.

Посевы инкубируются в анаэробных условиях 48 часов при 35С. Изучают морфологические свойства (приготовление мазка и окраска его по Грамму, Ожешко), культуральные свойства. Идентификацию проводят по биохимическим свойствам. Для этого разработаны специальные тест-системы (демонстрация).

ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ К ЗАНЯТИЮ № 6.

1. Ферменты бактерий: классификация ферментов бактерий, питательные среды, используемые для изучения ферментативной деятельности бактерий. Практическое значение определение ферментативной деятельности бактерий.

2. Идентификация бактериальной культуры (культуральные и биохимические свойства).

3. Дыхание бактерий. Методы культивирования анаэробов.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 7. Дата___________________

ТЕМА: БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ – ЗАКЛЮЧЕНИЕ О ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЕ. БАКТЕРИОФАГИ. АНТИБИОТИКИ. СТЕРИЛИЗАЦИЯ. ДЕЗИНФЕКЦИЯ. АНТИСЕПТИКА. АСЕПТИКА.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

1. Освоить заключительный этап бактериологического метода диагностики. Вывод о виде выделенной культуры.

2. Разобрать строение бактериофагов, а также их применение в практике.

3. Изучить методы идентификации бактерий по фаголизабельным свойствам.

4. Усвоить основные принципы классификации и механизмы действия антибиотиков.

5. Дать определения понятий: стерилизация, дезинфекция, антисептика, асептика.

6. Уяснить методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. Учет изменений сред пестрого ряда (идентификация чистой выделенной культуры по биохимическим свойствам) с прошлого практического занятия.

индол

сероводород

лактоза глюкоза мальтоза манит сахароза МПБ

Вывод:_______________________________

2. Учет опыта по определению фаголизабельных свойств выделенной культуры (опыт ставили на практическом занятии № 6).

О К

Вывод:_______________________________

3. Демонстрация: учет РНТФ по методу Грациа.

10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7

↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Вывод:_______________________________

4. Демонстрация: определение фаготипа стафилококков (фаготипирование).

Вывод:_______________________________

5. Демонстрация: определение чувствительности выделенной чистой культуры к антибиотикам по методу дисков.

6. Демонстрация современных методов определения чувствительности к антибиотикам (бак. анализаторы).

7. Посев микрофлоры кожи пальцев рук на ½ чашки с МПА.

8. Демонстрация стерильной посуды: завернутые пипетки, пробирки, чашки Петри.

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ.