А) темнопольная микроскопия

Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (бактериальных клеток) (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, которые заменяют обычный конденсор и имеют внутреннюю зеркальную поверхность, от которой отражаются световые лучи, большинство из которых проходит мимо объектива, создавая темное поле зрения, а небольшая часть отражается от находящихся в препарате бактериальных клеток и попадает в объектив, давая изображение объекта (”звезды на ночном небе”).карля). дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчай Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии готовят препараты раздавленная или висячая капля из нативного материала, поэтому бактерии исследуются в живом состоянии.

Б) фазово-контрастная микроскопия

Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные (неокрашенные) объекты. Пучок света, проходя через неокрашенный препарат, не теряет своей интенсивности, а меняет только скорость прохождения, т.е. изменяется фаза колебания света; такие фазовые колебания глаз не воспринимает, но с помощью фазово-контрастного устройства происходит превращение фазовых невидимых изменений в амплитудные контрастные видимые. Фазово-контрастное приспособление состоит из специального фазового конденсора, содержащего кольцевую диафрагму, и набора объективов, в которые вставлены фазовые пластинки в форме кольца. Конденсор и объективы устанавливают на обычном микроскопе. Пучок света, проходя через кольцевую щель диафрагмы и объект, попадает в кольцо фазовой пластинки объектива и глаз наблюдателя. Фазовый контраст может быть позитивным (темное изображение объекта в светлом поле зрения) или негативным (светлое изображение объекта на темном фоне).

В) люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия

Основана на явлении люминесценции (свечение объекта) под действием ультрафиолетового света (фотолюминесценция). Различают собственную (первичную) люминесценцию (без предварительного окрашивания объекта) и наведенную (вторичную) люминесценцию (после окраски флюорохромами). Большинство патогенных для человека бактерий не обладают собственной люминесценцией, поэтому их окрашивают специальными флюоресцирующими красителями.

ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ К ЗАНЯТИЮ №2

1. Ультраструктура бактериальной клетки: нуклеоид, цитоплазма, включения, рибосомы, цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, капсула, жгутики, ворсинки, споры. Химический состав, методы выявления и функции указанных структур.

2. Сложные методы окраски бактерий: окраска по методу Грама, Бурри-Гинса, Нейссера, Ожешки, Циля-Нильсена. Принципы этих методов, их назначение.

3. Методы микроскопии: люминесцентная, фазово-контрастная, темнопольная. Принципы этих методов и их назначение.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №3 Дата_____________________

ТЕМА: Морфология и ультраструктура микоплазм, риккетсий, хламидий, актиномицетов, спирохет, грибов.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

1. Современные представления о морфологии и ультраструктуре микоплазм, риккетсий, хламидий, актиномицетов, спирохет, грибов.

2. Методы изучения морфологии микоплазм, риккетсий, хламидий, актиномицетов, спирохет, грибов и их диагностическое значение.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА:

1. Просмотр с помощью иммерсионного микроскопа и зарисовка готовых окрашенных препаратов:

риккетсии боррелия возвратного тифа

в патологическом материале (окраска по Романовскому-Гимзе)

(окраска по Романовскому-Гимзе)

• актиномицеты дрожжеподобные грибы рода Candida

(окраска по Граму) (окраска метиленовым синим)

• микрокультуры плесневых грибов

Mucor Penicillium Aspergillus

2. Просмотр демонстрационных препаратов на темнопольном и фазово-контрастном микроскопе – бледная трепонема.

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ:

1. Микоплазмы

Выделяют 2 рода: Mycoplasma и Ureaplasma. Микоплазмы вызывают у человека пневмонию, урогенитальный микоплазмоз, урогенитальный уреаплазмоз.

2. Риккетсии

Выделяют 2 рода: Rickettsia и Coxiella. Риккетсии вызывают острые лихорадочные заболевания – риккетсиозы, передающиеся различными членистоногими: эпидемический вшивый сыпной тиф, эндемический крысиный сыпной тиф, лихорадку цуцугамуши, Ку-лихорадку и др.

3. Хламидии

Выделяют 2 рода: Chlamydia и Chlamydophila. У человека вызывают урогенитальный хламидиоз, трахому, венерическую лимфогранулему, орнитоз, пневмонию.

4. Актиномицеты

Патогенные для человека виды встречаются среди представителей родов Actinomyces, Nocardia, Streptomyces. Вызывают актиномикоз, нокардиоз, кожные мицетомы.

5. Спирохеты

В группу спирохет входят несколько родов: Treponema, Borrelia, Leptospira. К трепонемам относятся возбудители сифилиса, фрамбезии, пинты. К боррелиям относятся возбудители эпидемического возвратного тифа, эндемического клещевого возвратного тифа, болезни Лайма. Лептоспиры являются возбудителями лептоспироза.

6. Грибы

Все грибы делят на 4 класса (3 класса – совершенные грибы и 1 класс – несовершенные грибы). Заболевания, вызываемые грибами, называют микозами. Микозы подразделяются на поверхностные (поражаются кожа, волосы, ногти) и глубокие (поражаются внутренние органы).

1 класс – Фикомицеты (Phycomycetes). Патогенными являются представители рода Mucor. У человека вызывают мукоромикозы: поражения легких и печени, кератиты, отомикозы, вульвовагиниты, дерматомикозы.

2 класс – Аскомицеты (Ascomycetes). Патогенные представители относятся к следующим родам: Blastomyces, Criptococcus, Histoplasma, Candida, Aspergillus, Penicillium. Грибы рода Aspergillus могут вызывать аспергиллёз, поражающий кожу туловища, конечностей, носовые пазухи, легкие, бронхи, роговицу глаза. Грибы рода Penicillium могут вызывать пенициллезы – поражение кожи, ногтей, уха, верхних дыхательных путей и легких, а также генерализованную инфекцию с образованием очагов во внутренних органах. Грибы рода Candida вызывают кандидоз ротовой полости, вульвовагинит, бронхолегочный кандидоз, интертригинозный кандидоз (в крупных складках кожи), глубокий кандидоз с поражением печени, кишечника.

3 класс – Базидиомицеты (Basidiomycetes). К этому классу относятся многие съедобные и ядовитые грибы.

4 класс – Дейтеромицеты (Deuteromycetes). Для человека патогенны представители следующих родов: Trichophyton, Microsporon, Sporotrichum. Вызывают дерматомикозы (трихофития, микроспория).

Методы диагностики микозов:

1. Микроскопический:

а) волосы, чешуйки кожи, ногтевые пластинки обрабатывают 10-20% КОН (для растворения роговых масс), готовят препарат раздавленная капля, микроскопируют с сухим объективом

б) микроскопия гноя: либо окраска анилиновыми красителями, либо изучают неокрашенный препарат, приготовленный методом раздавленной капли

2. Микологический

Посев исследуемого материала на специальные питательные среды, выделение чистой культуры и идентификация. Чистые культуры получить трудно, мешают бактерии.

3. Аллергический

Используют пробы с аллергеном из культуры гриба. Обычно для диагностики глубоких микозов.

4. Серологический

Используют РСК, РА, РП, РНГА с частицами латекса, нагруженными антигеном, реакции иммунодиффузии. Положительные реакции свидетельствуют о распространенности процесса.

5. Биологический

Используют редко.

6. ПЦР

ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ К ЗАНЯТИЮ №3

1. Морфология и ультраструктура грибов, актиномицетов, риккетсий, хламидий, спирохет и микоплазм.

2. Заболевания, вызываемые этими микроорганизмами.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 4 Дата___________________

ОТЧЕТ ПО ТЕМЕ: МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ. МЕТОДЫ ОКРАСКИ

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

1. Определить уровень усвоения студентами пройденного материала.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1.Решение практических задач:

а) определение морфологии и ультраструктуры бактерий в готовых препаратах;

или

б) приготовление препарата из заданной культуры бактерий, окраска по Граму.

Вопросы для письменного контроля:

1. Особенности морфологии и ультраструктуры риккетсий

2. Особенности морфологии и ультраструктуры спирохет

3. Особенности морфологии и ультраструктуры актиномицетов

4. Особенности морфологии и ультраструктуры микоплазм

5. Особенности морфологии и ультраструктуры грибов

6. Строение и функции ядра, цитоплазмы, включений. Методы выявления включений

7. Строение и функции клеточной стенки Гр+ и Гр- бактерий

8. Строение и функции жгутиков. Методы выявления

9. Строение и функции капсулы. Методы выявления

10. Строение и функции споры. Методы выявления

11. Принципы иммерсионной, фазовоконтрастной и темнопольной микроскопии. Их использование в диагностике инфекционных заболеваний

12. Принципы люминесцентной и электронной микроскопии. Их использование в диагностике инфекционных заболеваний

13. Механизм окраски Гр+ и Гр-бактерий по Граму

14. Строение и функции ядра, цитоплазмы, цитоплазматической мембраны

15. Строение и функции клеточной стенки Гр+ и Гр- бактерий

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 5. Дата________________

ТЕМА: БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ПИТАНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

1. Знакомство с сущностью бактериологического метода диагностики и его основными этапами.

2. Усвоение классификации питательных сред и их состава.

3. Освоение методов выделения чистых культур аэробных бактерий.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. Разбор и запись графа «Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний».

2. Зарисовка демонстраций: характер роста бактерий на питательных средах, пигменты бактерий.

Рост бактерий на жидких питательных средах

придонный диффузный поверхностный

Пигменты бактерий

3. Описание культуральных свойств микроорганизмов, выросших при посеве из воздуха по схеме:

размер –

форма –

цвет –

поверхность –

прозрачность –

край –

структура –

консистенция –

4. Приготовление мазков из колоний и окраска по Граму.

5. Пересев материала колоний на скошенный агар для выделения чистой культуры.

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ.

1. Определение понятий: бактериологический метод диагностики – это выделение и идентификация чистой культуры; «чистая культура» – это бактерии одного вида, выделенные на питательной среде; «колония» – это потомство одной бактериальной клетки, выросшей на питательной среде.

2. Типы питание микроорганизмов.

- Автотрофы (сами себя питающие) используют в качестве единственного источника углерода для конструктивного метаболизма двуокись углерода, из которой способны синтезировать все углеродсодержащие компоненты клетки.

- Гетеротрофы (питающиеся за счет других) не способны усваивать двуокись углерода как единственный источник углерода, а получают его из различных органических соединений.

- Фототрофы способны использовать энергию солнечного света.

- Хемотрофы получают энергию за счет окислительно-востановительных реакций.

- Литотрофы используют в качестве доноров электронов неорганические соединения.

- Органотрофы используют в качестве доноров электронов только органические соединения.

Кроме того все бактерии делятся на 2 группы: прототрофы и ауксотрофы.

- Прототрофы способны синтезировать все соединения из глюкозы как единственного источника углевода и из солей аммония как единственного источника азота.

- Ауксотрофы не способны синтезировать какие-либо соединения из глюкозы и солей аммония как единственных источников углерода и азота. Ауксотрофами являются патогенные и условно-патогенные для человека микроорганизмы.

3. Классификацию питательных сред.

1. По консистенции (в зависимости от содержания агар-агара):

– жидкие (пептонная вода, сахарный бульон);

– полужидкие(0,5% МПА);

– твердые (2% МПА).

2. По составу:

– простые (МПА, пептонная вода);

– сложные (кровяной агар, сывороточный агар).

3. По назначению:

– элективные (1% пептонная вода, ЖСА);

– среды обогащения или селективные (среда Плоскирева);

– дифференциально – диагностические (среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева);

– транспортные или консервирующие (среды,содержащие глицерин).

Требования, предъявляемые к питательным средам:

1. содержание всех необходимых для размножения определенных микроорганизмов веществ в легкоусвояемой форме;

2. оптимальная влажность;

3. оптимальная вязкость;

4. оптимальная рН;

5. стерильность;

6. содержание ростовых факторов, которые играют роль католизаторов метаболических процессов;

7. среда должна быть изотоничной.

4. Рост и размножение бактерий.

Под ростом клетки понимают координированное воспроизведение некоторых клеточных компонентов и структур, ведущее в конечном итоге к увеличению массы тела. Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и др. могут служить им источниками питания только после расщепления экзоферментами до более простых соединений. Метаболиты и различные ионы проникают в микробную клетку тремя путями:

1. Пассивная диффузия. Протекает без энергетических затрат, по градиенту концентрации.

2. Облегченная диффузия. Не требует энергетических затрат. Протекает при участии мембранных белков-транслоказ.

3. Активный транспорт. Протекает с энергетическими затратами против градиента концентрации:

а) при участие пермеаз (каждая пермеаза переносит в клетку определенное соединение);

б) при участии мембранных белков-транслоказ.

Для питания бактерий, в зависимости от особенностей их метаболизма необходимы факторы роста, такие как аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, липиды, витамины.

Термин «размножение» означает увеличение числа бактериальных клеток в популяции. Размножение бактерий характеризуется временем генерации, т.е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки.

Длительность периода зависит от вида бактерий, ее возраста, характера питательной среды, температуры культивирования и др. Репликация ДНК и правильность расхождения дочерних цепей обеспечивается связью ДНК с ЦПМ. Репликация начинается в определенной точке (локус) ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Синтез дочерних идет ступенчато, короткими фрагментами, которые сшиваются ферментом лигазой.

Параллельно с репликацией ДНК начинается образование межклеточной поперечной перегородки. В начале с обеих сторон клетки происходит врастание двух слоев ЦПМ. Затем между ними синтезируется пептидогликан.

Одновременно синтезируются биополимеры рибосом и цитоплазмы. Затем – дочерние клетки отделяются друг от друга. В том случае когда разделившиеся бактериальные клетки сохраняют межклеточные связи, образуются цепочки, состоящие из шаровидных и палочковидных форм (стрептококки, стрептобактерии).

Фазы размножения:

– Исходная стационарная фаза начинается после высева культуры на питательную среду и продолжается 1-2 ч. В эту фазу число бактерий не увеличивается и клетки не растут.

– Лаг-фаза или фаза задержки размножения, характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой.

– Лог-фаза или логарифмическая, отличается максимальной скоростью размножения и увеличением бактериальной популяции. Поскольку каждая бактериальная клетка делится на две, число клеток в культуре возрастает в геометрической прогрессии. Продолжительность этой фазы несколько часов.

– Фаза отрицательного ускорения – бактериальные клетки становятся менее активными и период генерации постепенно удлиняется.

– Максимальная стационарная фаза – наступает равновесие между количеством клеток, находящихся в состоянии покоя, погибающих и вновь образующихся. Это равновесие сохраняется определенный период или быстро сменяется следующей фазой.

– Фаза гибели – увеличивается число погибших клеток.

– Фаза логарифмической гибели – отмирание клеток происходит с постоянной скоростью в геометрической прогрессии.

– Фаза уменьшения скорости отмирания клеток.

измы.

5. Выделение чистой культуры.

Существует 2 принципа выделения чистых культур, основанных:

а) на механическом разобщении бактерий, цель которого получение отдельных колоний (метод Дригальского); – см. приложение

б) на биологических свойствах бактерий:

– прогревание бактерий для выделения споровых культур;

– выделение кислото- и щелочеустойчевых бактерий (обработка кислотой и нейтрализация щелочью);

– использование разных типов дыхания;

– применение элективных, селективных и дифференциально-диагностических сред;

– выделение подвижных бактерий (посев по Шукевичу);

– использования чувствительных лабораторных животных.

6. Культуральные свойства – это описание характера роста бактерий на питательных средах;

а) рост на жидких питательных средах:

– поверхностный (в виде пленки);

– диффузный (равномерное помутнение);

– придонный (в виде осадка)

б) рост на плотных питательных средах (описание колоний следует проводить по схеме – приложение №4).

ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ К ЗАНЯТИЮ № 5.

1. Рост и размножение бактерий.

2. Питание бактерий.

3. Питательные среды, назначение, классификация.

4. Методы выделения и принципы культивирования аэробных бактерий.

5. Культуральные свойства бактерий.