Примечание

• При приготовлении мазков из жидких субстратов опустить п.2.

Простой метод окрашивания бактериальных препаратов (мазков)

1. На зафиксированный мазок:

   1. При применении растворов красителей нанести водно-спиртовый раствор краски – весь мазок должен быть покрыт краской.

   2. При применении красящих лент поместить ленту на препарат (мазок) и сверху намочить ленту водой и прижать к стеклу стеклянной палочкой.

2. Через 1-1,5 мин. (экспозиция зависит от вида красителя: для генцианвиолета – 1-2 мин., для фуксина – 1-1,5 мин., для метиленового синего – 3-5 мин.), смыть краску водой (краска должна остаться только на мазке) и промокнуть воду фильтровальной бумагой (все стекло должно быть сухим).

3. Микроскопировать с иммерсионной системой (см. правила иммерсионной микроскопии).

Примечание

1. Окраска мазков производится на мостиках (салазках), расположенных над кюветой.

2. При применении растворов красителей все краски и реактивы наносятся глазными пипетками, помещенными во флаконы с реактивами. После взятия реактива пипетку поместить в свой флакон.

3. Флаконы с реактивами и красителями из штатива не вынимать.

4. Для высушивания мазков пользоваться нарезанной фильтровальной бумагой (в штативе).

ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ К ЗАНЯТИЮ №1

1. Бактериологическая лаборатория – назначение, оборудование, правила и режим работы.

2. Морфология бактерий.

3. Иммерсионный микроскоп: устройство, ход лучей, увеличение, разрешающая способность. Правила работы с иммерсионным микроскопом.

4. Простые методы окраски бактерий. Бактериальные красители. Приготовление микроскопических препаратов.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №2 Дата ____________________

ТЕМА: Ультраструктура бактериальной клетки. Сложные методы окраски бактерий и их диагностическое значение. Методы микроскопии: люминесцентная, фазово-контрастная, темнопольная.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

1. Изучение ультраструктуры бактериальной клетки.

2. Приготовление препаратов из бактерий и их окраска по методу Грама.

3. Знакомство с методами люминесцентной, фазово-контрастной, темнопольной микроскопии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА:

1. П росмотр с помощью иммерсионного микроскопа и зарисовка готовых окрашенных препаратов:

дифтерийные палочки капсульные бактерии споры бактерий

с зернами волютина (окраска по методу (окраска по

(окраска по методу Бурри-Гинса) методу Ожешки)

Нейссера)

2. Приготовление препарата (мазка) из культур стафилококков и мелкой палочки, окраска по методу Грама, просмотр окрашенных препаратов и зарисовка увиденного в альбом:

смесь стафилококков и мелкой палочки

(окраска по методу Грама)

3. Просмотр демонстрационных препаратов: на люминесцентном микроскопе – туберкулёзная палочка, на темнопольном и фазово-контрастном – сенная палочка.

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ:

1. Основные отличия строения прокариотической клетки от эукариотической (гаплоидность, отсутствие ядерной мембраны, отсутствие органоидов (митохондрий, аппарата Гольджи, ЭПС), амитотическое деление).

2. Методы выявления основных структур бактериальной клетки:

1. капсула

Метод окраски по Бурри-Гинсу:

• смешать каплю взвеси бактерий с каплей туши и при помощи стекла сделать мазок, высушить и зафиксировать

• на мазок нанести водный раствор фуксина (на 1-2 минуты)

• промыть водой, высушить и микроскопировать. Бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно-розовом фоне.

2. клеточная стенка

Метод окраски по Граму:

• на фиксированный мазок нанести раствор генцианвиолета на 1-2 минуты, краситель слить

• нанести раствор Люголя на 1-2 минуты

• обесцветить спиртом в течение 30-60 секунд

• промыть водой

• докрасить раствором фуксина в течение 1-2 минут, промыть водой, высушить и микроскопировать

Гр+ бактерии – фиолетовые, Гр- бактерии – красные.

3. включения

Окраска по методу Нейссера (для выявления зерен волютина):

• на фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2-3 минуты

• добавить раствор Люголя на 10-30 секунд

• промыть водой

• мазок докрасить водным раствором везувина или хризоидина в течение 30-60 секунд

• промыть водой, высушить, микроскопировать

Зерна волютина имеют щелочную реакцию, поэтому воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма, имея кислую реакцию, воспринимает везувин и окрашивается в желтый цвет.

4. споры

Окраска спор по методу Ожешки:

• на нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени 2-3 минуты

• кислоту слить, препарат промыть водой, просушить, зафиксировать, затем окрасить по Цилю-Нильсену:

• нанести на мазок карболовый раствор фуксина и подогреть до появления паров в течение 3-5 минут

• промыть водой

• нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 минуты

• промыть водой

• докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут

• промыть водой, высушить и микроскопировать

Раствор карболовой кислоты разрыхляет оболочку спор и тем самым повышает её тинкториальные свойства, при этом споры и вегетативные формы окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные формы обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а споры остаются красными.

3. Принципы темнопольной, фазово-контрастной, люминесцентной микроскопии: