2 Лабораторная работа № 2 определение амилолитической активности фотоколориметрический методом

2.1 Определение амилолитической активности ферментов

солода

2.1.1 Сущность метода

Для точного определения активности ферментов необходимо строго соблюдать определенные условия проведения реакции, катализируемой ферментом (температура, рН среды, длительность реакции, концентрация субстрата и способы его приготовления, способы приготовления ферментного раствора).

На скорость ферментативной реакции большое влияние оказывает соотношение фермент-субстрат. Поэтому активность ферментов следует определять при строго постоянном соотношении фермента и субстрата, которое обеспечивает определенную степень гидролиза субстрата.

Активность ферментов находят с помощью графика, выражающего зависимость степени гидролиза субстрата от числа единиц активности фермента, взятого для реакции; на оси абсцисс этого графика откладывают количество взятого для анализа солода (или ферментного препарата), а на оси ординат – степень гидролиза субстрата. В большинстве случаев эта зависимость выражается прямой линией в пределах гидролиза от 15 до 75 %. Прямолинейный участок графика дает возможность по количеству субстрата, превращенного в процессе реакции, определять активность препарата. Для удобства расчета прямая графика может быть представлена в виде уравнения.

Амилолитическая активность (АС) характеризует способность ферментов солода катализировать расщепление крахмала в основном на декстрины с небольшим количеством олигосахаридов. Эта активность главным образом обусловлена присутствием -амилазы.

В основу определения амилолитической активности положена зависимость степени гидролиза крахмала от числа единиц фермента, взятого для проведения ферментативной реакции.

Для определения амилолитической способности крахмал гидролизуют вытяжкой исследуемого солода и определяют количество оставшегося негидролизованного крахмала после действия ферментов по йодкрахмальной реакции с использованием фотоэлектроколориметра.

При фотоколориметрическом методе определения за единицу амилолитической способности принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз крахмала при следующих условиях:

– температура реакции 30 С;

– рН раствора 4,8…4,9;

– продолжительность реакции 10 минут;

– объем 15 мл (10 мл субстрата и 5 мл ферментного раствора);

– постоянное соотношение в реакционной смеси фермент-субстрат, обеспечивающее гидролиз крахмала на 30 % за 10 мин.

2.1.2 Реактивы

– 1 %-ный забуференный раствор крахмала (картофельного) – навеску растворимого крахмала берут из такого расчета, чтобы в 100 мл раствора содержался 1 г сухого крахмала. Например, если влажность крахмала 13 %, то навеска крахмала в граммах для 100 мл 1 %-ного раствора должна составить:

Взвешенную на технических весах навеску крахмала без потерь переносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды и перемешивают, затем добавляют еще 25 мл воды и помещают колбу в кипящую водяную баню, выдерживая ее до полного растворения крахмала и непрерывно помешивая раствор. Содержимое колбы охлаждают до 20 С, добавляют 10 мл буферного раствора (рН 4,8…4,9), доводят водой до метки и перемешивают;

– буферный раствор (рН 4,8…4,9);

– 0,1 н раствор соляной кислоты;

– основной раствор йода – в тарированном стаканчике с притертой крышкой отвешивают 0,5 г йода и 5,0 г йодированного калия и добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают до полного растворения йода. Раствор переливают в мерную колбу с притертой крышкой на 200 мл, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Полученный раствор хранят в темном месте и используют в течение 30 дней;

– рабочий раствор йода – 2 мл основного раствора разбавляют в мерной колбе на 100 мл дистиллированной водой до метки. Перед употреблением необходимо проверить оптическую плотность рабочего раствора йода на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной грани 1,0 см при светофильтре с длиной волны =453 нм.

Оптическая плотность раствора йода должна быть равна 0,160  0,01. В случае отклонения оптической плотности раствора от этой величины ее приводят к необходимой добавлением нескольких капель воды или основного раствора йода;

– солодовая вытяжка – взвешивают на технических весах две навески измельченного солода – одну для определения влажности и вторую для определения АС. Величина навески просяного солода 10 г, ячменного, овсяного и ржаного 5 г. Навеску количественно переносят в химический стакан или коническую колбу на 200…250 мл, добавляют 10 мл буферного раствора (рН 4,7…4,9) и 90 мл дистиллированной воды.

Полученную смесь выдерживают в течение 60 мин при 30 С, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтруют и фильтрат используют в качестве основного раствора для определения АС. Для проведения ферментативной реакции готовят рабочий раствор, пользуясь данными таблицы 1.

Таблица 1 – Приготовление рабочих ферментных растворов солода

Ожидаемая активность солода, ед.АС	Масса солода в 5 мл рабочего раствора, мг	Расход основного раствора на приготовление рабочего раствора, мл/100 мл
Для просяного солода
5…10	30	6
11…15	20	4
16…20	10	2
Для ячменного, овсяного, ржаного солода
16…20	20	8
21…30	10	4
31…50	7,5	3