2.1.3 Проведение анализа

Осахаривание крахмала ведут в строго определенных условиях:

– температура 30 С;

– рН среды 4,8…4,9 ед. рН;

– продолжительность реакции 10 мин;

– объем раствора 15 мл (10 мл раствора крахмала +5 мл рабочего раствора ферментов солода).

Для анализа берут две пробирки (18х180 мл), наливают в каждую по 10 мл приготовленного раствора крахмала, ставят в ультратермостат или водяную баню с температурой 30 С  0,5 С и выдерживают в течение 10 мин. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую 5 мл дистиллированной воды (контрольный раствор), а во вторую – 5 мл солодовой вытяжки (опытный раствор). Смеси быстро перемешивают и выдерживают точно 10 мин при той же температуре.

После этого пробирки с реакционной смесью вынимают из термостата, отбирают из каждой по 1 мл и переносят в другие пробирки с предварительно налитыми туда 10 мл 0,1 н соляной кислотой, которая прерывает действие ферментов. Жидкости взбалтывают, от каждой пробы отбирают по 1 мл, переносят в новые пробирки, в которые предварительно налито по 10 мл рабочего раствора йода, и содержимое пробирок перемешивают.

Контрольный раствор окрашивается в синий цвет, опытный – в фиолетово-коричневый различной интенсивности, в зависимости от количества гидролизованного крахмала. Далее определяют оптическую плотность полученных растворов в кюветах с длиной грани 1,0 см при красном светофильтре с длиной волны =656 нм или близкой к этой величине. Колориметрирование проводят по сравнению с дистиллированной водой.

Оптическая плотность контрольного раствора соответствует количеству исходного крахмала субстрата во взятом растворе, а оптическая плотность опытного раствора – количеству крахмала, оставшемуся негидролизованным после действия ферментов. Этот крахмал надо понимать условно, так как фактически в растворе крахмала нет, он превратился в декстрины различной молекулярной массы, которые и дают фиолетово-коричневую окраску. Разность между оптической плотностью контрольного и опытного растворов соответствует количеству крахмала, которое подверглось гидролизу под действием ферментов солода.

Количество гидролизованного крахмала (в г) рассчитывают по формуле:

,

где D₁ – оптическая плотность контрольного раствора;

D₂ – оптическая плотность опытного раствора;

0,1 – количество крахмала, взятое для определения в качестве субстрата, г.

Если окажется, что количество гидролизованного крахмала больше 0,07 или меньше 0,02, то анализ повторяют, изменив разбавление рабочего раствора солодовой вытяжки.

Амилолитическую способность (ед./г) рассчитывают по формуле (3):

, .

где Сг.кр – количество гидролизованного крахмала субстрата, г;

n – масса солода, содержащаяся в 5 мл раствора, взятого для осахаривания крахмала, мг;

6,889 и 0,029388 – коэффициенты расчетного уравнения, полученные экспериментально для данных условий, установленные с учетом действия фермента в течение 60 мин.

2.2 Определение амилолитической активности микробных

ферментных препаратов