Условия для внедрения метода длительного хранения спермы в жидком азоте в практику.

1 Наличие жидкого азота. Его получают из воздуха при помощи генераторов (производительность от 5 до 25 литров в час).

2 Наличие сосудов для замораживания спермы.

3 Наличие стационарного хранилища для хранения замороженной спермы. Это большие сосуды (ХСЖА, КВ 6202; ХБ–0,5), которые позволяют хранить замороженную сперму без подзарядки жидким азотом около 3-х месяцев. Сосуды СДП-6…СДП-90 предназначены для станционарного хранения и транспортировки жидкого азота. Сосуды типа СДСТ отличаются от сосудов типа СДС увеличенным диаметром горловины. Это позволяет значительно увеличить количество хранимого биоматериала за счёт установки девяти канистр диаметром 45 мм или шести канистр диаметром 70 мм.

4 Наличие контейнеров малой емкости для транспортировки спермы на пункты искусственного осеменения (СДС-6…СДС –35).

Если непосредственно на племпредприятии жидкий азот не производят, то необходимо наличие транспортных рефрижераторов жидкого азота.

Теоретические основы замораживания спермы.

Первые опыты по замораживанию спермы животных показали, что спермии очень чувствительны к низким температурам, погибают при замораживании. Основной причиной гибели спермиев при замораживании считают механическое, разрушающее действие кристаллов льда, образующегося при охлаждении, как в плазме спермы, так и в самих спермиях. Кристаллы льда вызывают необратимые нарушения в структуре протоплазмы и оболочки спермиев.

В природе существует два вида замораживания: 1 – Кристаллическое замерзание – когда молекулы вещества распределяются в пространстве в определённом порядке, т.е. анизатропно. Кристаллическое замерзание происходит медленно, скачками, со значительными молекулярными перемещениями; 2 – Стекловидное замерзание – это такое замерзание, когда молекулы вещества распределены в пространстве хаотично. Физические свойства замёрзшего тела одинаковы по всем направлениям, т.е. изотропно. Стекловидное замерзание происходит быстро, внезапно без значительных молекулярных перемещений. Стекловидное замерзание менее вредно, чем кристаллическое.

В процессе замерзания сперма претерпевает три последовательных состояния:

1 Жидкое или полужидкое (около 0⁰ С);

2 Зона кристаллического замерзания (-40-60⁰С);

3 зона стекловидного замерзания (-150 до 273⁰ С).

Замораживание спермы надо проводить так, чтобы миновать стадию кристаллического замерзания. Это достигается 2-мя методами:

1 Быстрым охлаждением малых объёмов спермы (0,5-1,0 мл),

2 Замедленным трёхступенчатым охлаждением разбавленной спермы глицериновой средой (английский метод).

Защитные свойства глицерина и дмсо.

1 Причинами гибели спермиев при замораживании неразбавленной спермы являются:

- изменение концентрации солей в плазме спермы. Вода плазмы замерзает, а соли отлагаются. Создаётся гипертоническая среда.

- переход мелких кристаллов в крупные – т.е. механическое повреждение протоплазмы спермиев.

Для предохранения спермиев от гибели при замораживании спермы применяют глицерин и ДМСО. Их защитные действия сводятся:

- они отнимают влагу и спермии легко переносят зону кристаллизации при замораживании;

- они замерзают позднее, чем вода (сперма с глицерином замерзает при -10⁰ С);

- они обладают диффузностью и легко проникают в клетку и обратно;

- они обладают вязкостью, а вязкая среда трудно кристаллизуется.

Замораживание спермы быка в полипропиленовых соломинках.

В 1975 году Л.Кассу (Франция) впервые применил соломинки из пропилена для фасовки спермы быков ёмкостью 0,5 мл.

Для разбавления спермы быка применяют Лактозо-Глицерино-Желточную среду. В зависимости от активности и концентрации сперму быка разбавляют в 20-50 и более раз, с таким расчётом, чтобы в дозе было не менее 15 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением. После предварительной оценки сперму переливают в градуированный смеситель ёмкостью 100-200 см³ и измеряют объём. Разбавитель, подогретый до температуры 25…30С, небольшими порциями приливают по стенке ёмкости со спермой и осторожно перемешивают после добавления каждой порции. Разбавленную сперму расфасовывают в стерильные полипропиленовые соломинки ёмкостью 0,25 см³. Каждую соломинку маркируют (указывают наименование предприятие, кличку и инвертарный номер быка, дату получения спермы и номер серии.

Для автоматического наполнения соломинок спермой и укупорки используют машину М6-МУ2-С. В цилиндр наливают разбавленную сперму, а специальное устройство наполняют стерильными стеклянными или металлическими шариками для укупорки. Соломинки укупоривают с обоих концов: один шарик служит в качестве пробки-поршня, другой - герметизирующей пробкой. На каждой соломинке делают надписи маркировочной машиной, указывающие наименование предприятия, кличку и инвентарный номер быка, а также дату получения спермы, номер серии. После наполнения соломинок между спермой и одним из шариков остаётся воздушный пузырёк длиной 8-18 мм. Чтобы воспрепятствовать попаданию жидкого азота внутрь соломинок во время замораживания и хранения, пузырёк перемещают в середину соломинки путём энергичного встряхивания. Соломинки устанавливают в штативы, которые выдерживают в холодильнике 3-4 часа при 2-4⁰ С. Замораживают сперму на щите из нержавеющей стали толщиной 1,5-2 мм в стационарном хранилище в газообразном азоте при температуре – 150⁰ С в течение 7 минут. Одновременно замораживают до 750 спермодоз. После замораживания соломинки со спермой помещают в пластмассовые стаканы, предварительно наполненные жидким азотом. Для сбора соломинок используют специальный собиратель с деревянной ручкой. Хранят замороженную сперму в стационарных хранилищах типа КВ-6202,ХБ в пластмассовых стаканах полностью погруженных в жидкий азот.

Замораживание спермы быка в облицованных гранулах.

Для разбавления спермы используют два устройства, которые заполняют средами 1 и 2. Устройство со средой 1 размещают в термостате при температуре 35⁰ С, устройство со средой 2 используют в условиях 18-22⁰ С. После получения сперму разбавляют средой 1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре в течение 5-10 минут, до окончания оценки эякулята. Затем дополнительно её разбавляют средой 2, имеющей комнатную температуру, до требуемой концентрации спермиев в дозе, согласно таблиц. Фасуют разбавленную сперму в стерильную тонкостенную полимерную трубку диаметром 3,8-4 мм, которая выпускается в виде бабин. Заполненную спермой трубку заправляют в автомат ПРЖ, который автоматически разделяет её на спермодозы объёмом 0,25-0,33 см³. Спермодозы собирают в маркированные алюминивые тубы. Затем тубы ввинчивают в обоймы устройства для эквилибрации и замораживания спермы (ЭКЗ). Устройство помещают в холодильник (2…5⁰ С), где сперма выдерживается в течение 4-6 часов при постоянном вращении со скоростью 2-10 об/мин.мс. После эквилибрации сперму замораживают в течение 8-10 минут в жидком азоте.