29. Жидкостная хроматография. Общие принципы, сорбенты для ситовой, молекулярной и хемосорбционной хроматографии, колонки, блок-схема и аппаратура для проведения жидкостной хроматографии, виды и характеристика детекторов.

Жидкостная хроматография  это метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой служит жидкость. Он применим для разделения более широкого круга веществ, чем метод газовой хроматографии. Это связано с тем, что большинство веществ не обладает летучестью, многие из них неустойчивы при высоких температурах (особенно высокомолекулярные соединения) и разлагаются при переводе в газообразное состояние.

Если в газовой хроматографии газ-носитель выполняет только транспортную функцию и неподвижной фазой не сорбируется, то жидкая подвижная фаза в жидкостной хроматографии является активным элюентом, его молекулы могут сорбироваться неподвижной фазой. При прохождении через колонку молекулы компонентов анализируемой смеси, находящиеся в элюенте, должны вытеснить молекулы элюента из поверхностного слоя сорбента, что приводит к уменьшению энергии взаимодействия молекул анализируемого вещества с поверхностью сорбента. Поэтому величины удерживаемых объемов V_R, пропорциональные изменению свободной энергии системы, в жидкостной хроматографии меньше, чем в газовой хроматографии, а диапазон линейности изотермы сорбции в жидкостной хроматографии шире.

Жидкая подвижная фаза имеет большую плотность и вязкость, чем газообразная, коэффициенты диффузии D_ж на 34 порядка ниже, чем в газе. Это приводит к замедлению массобмена в жидкостной хроматографии по сравнению с газовой хроматографией. Уравнение Ван-Деемтера, в связи с тем, что член В в жидкостной хроматографии роли не играет (D_ж  D_г), видоизменяется и графическая зависимость эффективности Н от линейной скорости потока подвижной фазы имеет вид, представленный на рис. 1.8.

В классическом варианте колоночной жидкостной хроматографиив стеклянную колонку 1–2 м, заполненную сорбентом с размером частиц  100 мкм и элюентом, вводят анализируемую пробу, растворенную в элюенте, и пропускают элюент, отбирая на выходе из колонки порции элюата. Этот анализ жидкостной хроматографии продолжителен. Современный вариант жидкостной хроматографии  так называемая ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография  использует объемно- и поверхностно-пористые сорбенты с размером частиц 5–10 мкм, нагнетательные насосы, обеспечивающие давление в системе до 400 атм., высокочувствительные детекторы. Быстрый массоперенос и высокая эффективность разделения позволяют использовать ВЭЖХ для разделения молекул (жидкостно-адсорбционная и жидкость-жидкостная распределительная хроматография), для разделения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная хроматография), для разделения макромолекул (эксклюзионная хроматография).

Выбор подвижной фазы часто важнее, чем выбор неподвижной. Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые вещества. В качестве неподвижной фазы в адсорбционной жидкостной хроматографии (молекулярная) применяют полярные и неполярные тонкодисперсные пористые материалы с удельной поверхностью более 50 м²/г. Полярные адсорбенты (SiO₂, Al₂O₃, флорисил и др.) имеют на поверхности слабокуислотные группы, способные удерживать вещества с основными свойствами. Эти адсорбенты применяют главным образом для разделения неполярных и среднеполярных соединений. Их недостаток  высокая чувствительность к содержанию воды в используемых элюентах. Для устранения этого недостатка полярные сорбенты обрабатывают аминами, диолами и др. реагентами, в результате чего происходит поверхностная прививка этих реагентов, модифицирование поверхности и изменение селективности по отношению к анализируемым веществам.

Неполярные адсорбенты (графитированные сажи, диатомит,) неселективны к полярным молекулам. Для получения неполярных адсорбентов часто на поверхность, силикагеля прививают неполярные группы, алкилсилильные SiR₃, где R  алкильные группы С₂ С₂₂.

В распределительной хроматографии разделение компонентов анализируемой пробы обусловлено различиями в коэффициентах их распределения между двумя не смешивающимися между собой жидкими фазами, одна из которых неподвижная и находится на поверхности или в порах твердого неподвижного носителя, а вторая  подвижная. В качестве твердых носителей используют вещества, индифферентные по отношению к подвижному растворителю и компонентам анализируемой пробы, но способные удерживать на поверхности и в порах неподвижную фазу. Чаще всего в качестве носителей используют полярные вещества  целлюлозу, силикагель, крахмал. На них наносят неподвижную фазу  полярный растворитель, воду или спирт. В качестве подвижных фаз в этом случае используют менее полярные или неполярные вещества  спирты, амины, кетоны, углеводороды и др. Такой вариант распределительной хроматографии называется нормально-фазовым. Он применяется для разделения полярных веществ.

Второй неподвижной твердой фазы используют неполярные носители  резину, фторопласт, гидрофобизированный силикагель, в качестве неподвижной жидкой фазы  неполярные растворители (углеводороды), а в качестве подвижной фазы  полярные растворители (спирты, альдегиды, кетоны и др., часто вода). Этот вариант распределительной хроматографии называется обращенно-фазовой распределительной хроматографией и используется для разделения неполярных веществ.

В основе методов ионообменной, ионной и ион-парной (хемосорбционная) хроматографии лежит динамический процесс замещения ионов, связанных с неподвижной фазой, ионами элюента, поступающими в колонку. Основная цель хроматографического процесса  разде-ление неорганических или органических ионов одного и того же знака. Удерживание в этих видах хроматографии определяется изменением свободной энергии реакции ионного обмена. Соотношение концентраций обменивающихся ионов в растворе и в фазе сорбента определяется ионообменным равновесием. Ионный обмен заключается в том, что некоторые вещества (ионообменники) при погружении в раствор электролита поглощают из него катионы или анионы, выделяя в раствор эквивалентное количество других ионов с зарядом того же знака. Между катионообменником и раствором происходит обмен катионами, между анионообменником и раствором – обмен анионами.

Эксклюзионная хроматография подразделяется на гель-проникающую и гель-фильтрационную. В гель-проникающей хроматографии (ситовой) разделение происходит на полимерах, набухающих в органических растворителях. Гель-фильтрационный вариант эксклюзионной хроматографии предполагает использование в качестве неподвижных фаз полимеров, набухающих в воде.

Продолжительность удерживания компонентов анализируемой пробы в эксклюзионной колонке зависит от размеров их молекул и диффузии в поры сорбента, а также от размеров пор неподвижной фазы. Каждый сорбент, используемый в эксклюзионной хроматогафии, характеризуется определенным объемом пор и, следовательно, имеет определенную область разделяемых молекулярных масс и определенный градуировочный график. При этом градуировочный график, характеризующий зависимость удерживаемого объема от молекулярной массы или размера молекул, имеет, как правило, сложный вид.

Блок-схема хроматографа

Д озатор  это устройство для ввода в хроматографическую колонку газовой, жидкой или твердой анализируемой пробы. Дозатор дорлжен удовлетворять следующим требованиям:

- обеспечивать воспроизводимость величины пробы;

- его внутренняя поверхность должна быть индифферентна к компонентам анализируемой пробы;

- он должен быть конструктивно прост, удобен в работе и дешев.

Для ввода пробы в каждом хроматографе есть приспособление (в газовых хроматографах  это так называемая испарительная камера) Оно установлено непосредственно у входа в хроматографическую колонку или вблизи ее и представляет собой небольшую емкость, соединенную с началом хроматографической колонки и снабженную самоуплотняющейся термостойкой резиновой мембраной. В испарителе газовых хроматографов должен поддерживаться такой температурный режим, который обеспечивает полное и быстрое испарение жидкого или твердого образца без его термоокислительного разрушения

Основной узел хроматографа  колонка, узел, в котором непосредственно происходит разделение анализируемой пробы на компоненты. Изготавливают из различных материалов  стекла, нержавеющей стали, латуни, меди, полимерных материалов. Внутр. диаметр колонки опр. целью анализа и видом хр-фии. Длина колонки м. составлять от неск. см до неск. десятков м.

По форме: прямые, Uобразные и спиральные колонки. Форма не влияет на разделение.

Общая классификация колонок: насадочные, микронасадочные, капиллярные

Капиллярные колонки бывают типов:

- WCOT-колонки - тонкая пленка неподвижной фазы нанесена непосредственно на внутреннюю поверхность колонки, используются наиболее часто.

- PLOT-колонки - это кварцевые капиллярные колонки, на внутренние стенки которых нанесен слой адсорбента.

- SCOT-колонки - капиллярные колонки, на внутренних стенках которых нанесен слой носителя с НФ

Хроматографические колонки для жидкостной хроматографии рассчитаны, в основном, на комнатную температуру. Однако в ряде случаев, например при анализе полимерных систем, необходимо работать при повышенных температурах (для повышения растворимости полимеров в подвижной фазе).

Детектор  это спец. блок хроматографической системы, реагирующий на различие в составе подвижной фазы, не содержащей компонентов разделяемой смеси, и подвижной фазы с разделенными компонентами, выходящими из колонки. Сигнал детектора после необходимого усиления подается на регистрацию пишущим потенциометром или компьютерными системами.

В жидкостных хроматографах используются следующие детекторы: рефрактометрические; фотометрические; флуоресцентные; электрохимические, масс-спектрометрические, инфракрасные и некоторые другие.

В рефрактометре Френеля. луч света падает на поверхность раздела двух оптических сред. Количество света, отраженного от поверхности раздела двух фаз (жидкость/стекло), пропорционально разности показателей преломления и углу падения света на поверхность раздела. Если угол падения подобрать таким образом, чтобы угол проникания был ~ 90° (т.е. близок к полному углу отражения), то небольшие изменения показателя преломления приведут к значительным изменениям интенсивности отраженного луча. Вместимость кювет составляет 35 мкл, т. е. возможна работа при небольших расходах элюента. Рефрактометр Френеля наиболее чувствителен к пульсациям потока, имеет меньший линейный диапазон. Высокие требования предъявляются к чистоте стекла.

Фотометрические детекторы подразделяют на:

1 Фотометры с фиксированной длиной волны

Источником света в детекторах этого типа является ртутная лампа низкого давления; детектирование проводится на длине волны 253,7 нм, на которой излучается 90% излучения. Свет от источника излучения проходит через проточную ячейку, в которую из хроматографической колонки поступает поток элюента. Для аналитических колонок диаметром 46 мм, заполненных сорбентом с размером частиц 57 мкм, обычно применяются ячейки с длиной оптического пути 10 мм, диаметром светового канала около 1 мм и рабочим объемом 8 мкл. Увеличение рабочего объема кюветы может привести к нежелательному размыванию хроматографических пиков.

2 Фотометрические детекторы с детектированием на длине волны, дискретно изменяемой с помощью оптических фильтров, отличаются от детекторов с фиксированной длиной волны источником с широким спектром испускаемого излучения и тем, что для выделения узкого диапазона длин волн, соответствующего максимуму поглощения детектируемых компонентов используется набор стеклянных или интерференционных фильтров. Фотометрические детекторы этого типа более универсальны и чувствительны по сравнению с фотометрами с фиксированной длиной волны.

3 Спектрофотометр с перестраиваемой длиной волны

состоит из источника света, монохроматора и фотоприемника

В качестве источника света используется дейтериевая лампа ДДС-30 с непрерывным спектром испускаемого излучения от 190 до 600 нм. Необходимую спектральную линию, длина которой, как правило, соответствует максимуму спектра поглощения определяемого компонента, выделяют с помощью либо дифракционных решеток, имеющих 10003000 штрихов на 1 мм, либо интерференционных фильтров с заданной шириной спектральной полосы.

Монохроматический пучок света поочередно проходит через рабочую и сравнительную проточные кюветы, и измеряется оптическая плотность или пропускание излучения на выделенной длине волны.

4 При использовании спектрофотометрического детектора с фотодиодной линейкой проба сканируется каждые несколько миллисекунд, т. е. спектральная информация выдается практически постоянно. Непрерывное излучение от источника проходит через проточную рабочую ячейку и попадает на дифракционную решетку. Луч отклоняется и фокусируется на плоскости, где расположена фотодиодная линейка называемое люминесцентны

5 Большие аналитические возможности предоставляет флуориметрический детектор. Он основан на том, что многие вещества при поглощении избыточной энергии, например, энергии света с соответствующей частотой, способны давать собственное излучение, характеризующееся определенным для каждого вещества набором длин волн В тех случаях, когда само вещество не флуоресцирует, можно до или после разделения исследуемого образца на колонке получить соответствующие флуоресцирующие производные.

Электрохимические детекторы реагируют либо на изменение свойств элюента, либо на конкретное анализируемое соединение. К первому типу относится кондуктометрический детектор, ко второму  амперометрические. Большинство электрохимических детекторов работают в амперометрическом режиме, при котором поддерживается постоянное напряжение между двумя электродами, погруженными в поток элюента, и регистрируется зависимость силы тока от времени.

Кондуктометрический детектор построен на том, что при создании разности потенциалов ионы, находящиеся в растворе, начинают перемещаться по направлению к электродам. Проводимость зависит от числа заряженных частиц в растворе  именно эта зависимость и положена в основу количественной оценки в кондуктометрии. Детекторы данного типа наиболее пригодны для определения заряженных соединений в элюате, предпочтительны при анализе малых концентраций ионов.

Вольтамперометрический детектор измеряет электрический ток в ячейке, возникающий при окислении (восстановлении) регистрируемого вещества на поверхности рабочего электрода при подаче на него определенного напряжения. Этот детектор обладает очень высокой чувствительностью,

30. Выбор подвижной фазы (пф) в жидкостной хроматографии (элюирующая сила и селективность) и условий разделения. Подготовка растворителя, колонки, пробы качественный анализ.

Особенности всех видов жидкостной хроматографии обусловлены тем, что подвижной фазой в ней является жидкость, а сорбция компонентов из газообразного и жидкого элюента протекает по-разному. Если в газовой хроматографии газ-носитель выполняет только транспортную функцию и неподвижной фазой не сорбируется, то жидкая подвижная фаза в жидкостной хроматографии явл. активным элюентом, его молекулы могут сорбироваться неподвижной фазой. При прохождении через колонку молекулы компонентов анализируемой смеси, находящиеся в элюенте, должны вытеснить молекулы элюента из поверхностного слоя сорбента, что приводит к уменьшению энергии взаимодействия молекул анализируемого вещества с поверхностью сорбента. Поэтому величины удерживаемых объемов V_R, пропорциональные изменению свободной энергии системы, в жидкостной хроматографии меньше, чем в газовой хроматографии, а диапазон линейности изотермы сорбции в жидкостной хроматографии шире.

Применяя различные элюенты, можно изменять параметры удерживания и селективность хроматографической системы. Селективность в жидкостной хроматографии в отличие от газовой хроматографии определяется не одним, а двумя факторами  природой подвижной (элюент) и неподвижной фаз.

Жидкая подвижная фаза имеет большую плотность и вязкость, чем газообразная, коэффициенты диффузии D_ж на 34 порядка ниже, чем в газе. Это приводит к замедлению массобмена в жидкостной хроматографии по сравнению с газовой хроматографией. Уравнение Ван-Деемтера, в связи с тем, что член В в жидкостной хроматографии роли не играет (D_ж  D_г), видоизменяется и графическая зависимость эффективности Н от линейной скорости потока подвижной фазы имеет вид, представленный на рис. 1.8. В классическом варианте колоночной жидкостной хроматографиив стеклянную колонку 1–2 м, заполненную сорбентом с размером частиц  100 мкм и элюентом, вводят анализируемую пробу, растворенную в элюенте, и пропускают элюент, отбирая на выходе из колонки порции элюата. Этот вариант жид. Хром-фии до настоящего времени применяют в лабораторной практике, но так как скорость прохождения элюента под действием силы тяжести мала, анализ продолжителен. Современный вариант ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография  использует объемно- и поверхностно-пористые сорбенты с размером частиц 5–10 мкм, нагнетательные насосы, обеспечивающие давление в системе до 400 атм., высокочувствительные детекторы. Быстрый массоперенос и высокая эффективность разделения позволяют использовать ВЭЖХ для разделения молекул (жидкостно-адсорбционная и жидкость-жидкостная распределительная хроматография), для разделения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная хроматография), для разделения макромолекул (эксклюзионная хроматография).

В адсорбционная жидкостная хроматография подвижная фаза, т.е. растворитель, должна обеспечивать различную емкость колонки и эффективное разделение за приемлемое время. Подвижная фаза должна полностью растворять анализируемую пробу, обладать невысокой вязкостью (чтобы коэффициенты диффузии были достаточно большими), желательно, чтобы из нее было возможно выделение разделенных компонентов. Она должна быть инертной по отношению к материалам всех частей хроматографа, безопасной, дешевой, подходящей для детектора.

Подвижные фазы, применяемые в жидкостной хроматографии, различаются по своей элюирующей силе. Элюирующая сила растворителя показывает во сколько раз энергия сорбции данного элюента на данном адсорбенте больше, чем энергия сорбции элюента, выбранного в качестве стандарта, например, н-гептана. Слабые растворители слабо адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициенты распределения сорбируемых веществ (сорбата) высокие. Наоборот, сильные растворители адсорбируются хорошо, поэтому коэффициенты распределения сорбата низкие. Растворитель тем сильнее, чем выше растворимость в нем анализируемой пробы, чем сильнее взаимодействие растворитель – сорбат.

В жидкостной хроматографии часто применяют не индивидуальные растворители, а их смеси. Часто незначительные добавки другого растворителя, особенно воды, существенно увеличивают элюирующую силу элюента.

При разделении многокомпонентных смесей одна подвижная фаза в качестве элюента может не разделить все компоненты пробы за приемлемое время. В этом случае применяют метод ступенчатого или градиентного элюирования, при котором в процессе хроматографирования последовательно применяют все более сильные элюенты, что позволяет элюировать сильноудерживаемые вещества за меньшее время.

В жид. хроматографии существуют некоторые эмпирические правила, при выборе элюента:

 сорбция соединения, как правило, увеличивается с увеличением в нем количества двойных связей и ОН-групп;

 сорбция уменьшается в ряду органических соединений: кислоты  спирты альдегиды кетонысложные эфиры  ненасыщенные углеводороды  насыщенные углеводороды;

 для разделения веществ разной полярности и разделдения веществ разных классов применяют нормально-фазовую хроматографию: анализируемая проба растворяется и элюируется неполярным элюентом, соединения разных классов выходят из колонки с полярным адсорбентом за разное время, при этом время удерживания соединений с разными функциональными группами увеличивается при переходе от неполярных соединений к слабополярным. Для очень полярных молекул значения времени удерживания так велики, что при использовании неполярного элюента анализ невозможен. Для уменьшения времени удерживания полярных компонентов переходят к полярным элюентам;

 в обращенно-фазовом варианте неподвижная фаза (неполярный адсорбент) сильнее адсорбирует неполярный компонент из полярных элюентов, например из воды;

 снижая полярность элюента добавлением менее полярного растворителя, можно уменьшить удерживание компонентов.

В распределительной или жид.-жид. хроматографии к жидким фазам предъявляются следующие требования:

1) используемые растворители должны хорошо растворять разделяемые вещества, причём их растворимость в неподвижной фазе должна быть больше, чем в подвижной. 2) растворители, используемые в качестве подвижной и неподвижной фаз, должны быть взаимонасыщаемы, 3) взаимодействие растворителей, используемых в качестве подвижной фазы, с неподвижной фазой должно быть минимальным.

Чаще всего в распределительной жидкостной хроматографии в качестве подвижных жид. фаз используют не индивидуальные вещ-ва, а их смеси в различных соотношениях. Это позволяет регулировать полярность подвижной фазы. Изменять соотношение полярностей подвижной и неподвижной фаз и добиваться оптимальных условий разделения компонентов конкреной анализируемой смеси.