7.3. Визначення аміногрупи за реакцією з нінгідрином (метод Лі та Такахамі)

Метод базується на кількісному визначенні аміногруп за реакцією з нінгідрином .

З досліджуваним розчином проводять реакцію з нінгідрином у присутності гліцерину, визначають оптичну густину фотоколориметрично та концентрацію амінокислот знаходять за калібрувальним графіком, побудованим за стандартним розчином гліцину.

Побудова калібрувального графіка

Вихідний розчин готують розчиненням 20 мг гліцину в 50 см³ води (концентрація 400 мкг/см³). З вихідного розчину готують робочі розчини розведенням за схемою:

1) 40 мкг/ см³ — 1 см³ вихідного розчину + 9 см³ води;

2) 20 мкг/ см³ — 5 см³ розчину 1 + 5 см³ води;

3) 10 мкг/ см³ — 5 см³ розчину 2 + 5 см³ води;

4) 5 мкг/ см³ — 5 см³ розчину 3 + 5 см³ води;

5) 2,5 мкг/ см³ — 5 см³ розчину 3 + 5 см³ води.

Для побудови калібрувального графіка проводять реакцію з усіма робочими розчинами гліцину; 2,4 см³ гліцерину змішують у пробірці зі шліфом з 2 см³ 1 % -го розчину нінгідрину в буфері; струшують до зникнення опалесценції, потім додають 0,6 см³ досліджуваного робочого розчину гліцину і знову струшують. Пробірки на шліфах закривають повітряним холодильником і ставлять на 12 хв. у киплячу водяну баню. Після закінчення зазначеного часу проби поміщають у холодну воду на 10 хв. (проточна вода). У контрольну пробірку замість розчину гліцину поміщають 0,6 см³ цитратного буфера.

Отримані забарвлені проби фотоколориметрують, використовуючи жовтий світлофільтр (λ=570...582нм). За отриманими даними будують графік залежності оптичної густини від концентрації амінокислоти (0,6 см³ розчину).

Хід роботи

З досліджуваними розчинами проводять реакцію з нінгідрином так, як для побудови калібрувальної кривої, тільки замість розчину гліцину додають по 0,6 см³ досліджуваної проби. Після вимірювання оптичної густини на ФЕК концентрацію амінокислот у пробі в перерахунку на гліцин знаходять за калібрувальним графіком.

Запитання для самоперевірки

1. Які методи кількісного визначення амінокислот ви знаєте?

3. Які принципи покладені в основу виділення амінокислот за допомогою хроматографії?

4. Принцип методу визначення амінокислот формольним титруванням?

5. Поясніть хімізм процесу при визначенні амінного азоту мідним способом.

6. Як здійснюється визначення аміногруп за реакцією з нінгідрином?

7. Принцип визначення λ-аміногруп амінокислот за реакцією з нінгідрином.

Література

Лабораторна робота №8 білки. Отримання та аналіз білків тваринного і ролинного походження

Мета роботи: отримати білок тваринного та рослинного походження та вивчити його властивості.

Завдання 1: ознайомитись з методом отриманя кристалічного яєчного альбуміну.

Завдання 2: ознайомитись з методом виділення казеїну з молока та вивчити його фізико-хімічні властивості.

Завдання 3: ознайомитись зі спектрофотометричними методами визначення білку.

Установки, прилади, лабораторний посуд, реактиви

Водяна баня; мірний циліндр на 100 см³; хімічний стакан на 50 см³; рН-метр; хімічний стакан на 200 см³; ступка з пестиком; спектрофотометр або ФЕК; мірна колба на 200 см³; свіжі курячі яйця; сульфат амонію кристалічний; насичений розчин сульфату амонію (757 г солі розчиняють у мірній колбі на 1 дм³ при слабкому нагріванні на водяній бані і після охолодження доводять до риски водою); 4 %-а оцтова кислота; знежирене молоко; 0,1 %-а оцтова кислота; 0,1 %-й розчин карбонату натрію; етанол, диетиловий ефір, суміш метилового спирту та хлороформу (1:1); сірчана концентрована кислота; азотна концентрована кислота; 5 н гідроксид натрію; 0,1 н розчин ацетату натрію; 0,1 н розчин їдкого натру; реактив А (2 % -й розчин вуглекислого натру в 0,1 н розчині їдкого натру); реактив В (0,5 %-й розчин сірчанокислої міді в 1 %-му розчині виннокислого натрію або калію. Розчиняють 10 г виннокислого натрію або калію в 300 см³ дистильованої води, в отриманий розчин вносять 5 г сірчанокислої міді і після її розчинення об'єм доводять дистильованою водою до 1 дм³); реактив С (перед аналізом 49 см³ реактиву А змішують з 1 см³ реактиву Б); вольфрамовокислий натрій х.ч. Na₂WO₄•2Н₂О; молібденовокислий натрій х.ч. Na₂MoO₄•2Н₂О; ортофосфорна кислота; концентрована соляна кислота; сірчанокислий літій; реактив Фоліна (в круглодонну колбу на 1,5...2 дм³ вносять 100 г вольфрамовокислого натрію і 25 г молібденовогокислого натрію і розчиняють їх у 700 см³ дистильованої води. До розчину додають 50 см³ 85 % -ї фосфорної кислоти і 100 см³ концентрованої соляної кислоти. До колби приєднують зворотний холодильник і суміш кип'ятять на сітці протягом 10 год, після чого в колбу вносять 150 г сірчанокислого літію, додають 50 см³ дистильованої води і 5 крапель бромної води. Суміш кип'ятять без холодильника 15 хв під тягою. Потім розчин охолоджують до кімнатної температури, доводять об'єм водою до 1 л, фільтрують і зберігають у темній склянці з притертою пробкою. Потрібно визначати кислотність отриманого розчину. Для цього реактив розбавляють в 10 раз і титрують 0,1 н розчином їдкого натру по фенолфталеїну); реактив Е (готують з реактивом Фоліна, розбавляючи його дистильованою водою так, щоб кислотність готового розчину була 1 н. Якщо при титруванні реактиву Фоліна виявилось, що його лужність становить 2,3 н, для приготування реактиву Е потрібно взяти 10 см³ реактиву Фоліна і 13 см³ дистильованої води. Реактив Е можна зберігати тривалий час); Препарат електрофоретично чистого білка.