2. Колориметричний метод визначення активності α- та β- амілази.

Під дією амілази у рослинах відбувається гідроліз високополімерного вуглеводу – крохмалю – з утворенням декстринів та мальтози. У рослинах зустрічаються α- та β – амілази.

Окреме кількісне визначення активності α - та β – амілаз основане на їх різній термостабільності: β – амілаза руйнується нагріванням до 70 ºС, α - амілаза при цьому зберігає свою активність.

Метод оснований на визначенні кількості крохмалю, що не розщепився амілазою на фотоелектроколориметрі після обробки розчином йоду.

Хід визначення.

Наважку 0,5…1 г борошна чи проростків розтирають у ступці з невеликою кількістю 1 %-го NaCl та переносять у конічна колбу на 50 см³. Співвідношення між наважкою та розчином NaCl 1 : 20. Вміст колби добре перемішують та залишають стояти при кімнатній температурі протягом 30 хв, періодично збовтуючи. Потім фільтрують через товстий складчастий фільтр. При поганому фільтруванні можна поєднувати фільтрування та центрифугуровання при 4000…5000 об/хв. Прозорий розчин використовують як ферментний препарат.

Д л я в и з н а ч е н н я а к т и в н о с т і α - т а β – а м і л а з и беруть 4 пробірки (2 дослідні та 2 контрольні ) та вносять в них по 3 см³ ацетатного буферу та 3 см³ 2 %-го розчину крохмалю. Суміш нагрівають на водяній бані або в термостаті до 40 ºС. Потім у дослідні пробірки вносять по 0,2...1,0 см³ ферментного препарату (в залежності від активності амілаз у об’єкті вивчення ), а у контрольні – таку ж саму кількість H₂O. Вміст пробірок перемішують та ставлять у термостат при 40 ºС на 30 або 60 хв. Після інкубації в кожну пробірку зразу доливають по 2 см³ 1 н. розчину HCl для припинення дії амілаз.

Для виявлення крохмалю, що не прореагував з ферментом проводять реакцію з йодом. В мірні колби на 50 см³ доливають біля 30 см³ води, 1 см³ 0,1 н. HCl, 5 краплин 0,3 %-го розчину йоду та вносять з кожної пробірки по 0,5 см³ суміші. Вміст колб добре перемішують, доводять до риски водою та колориметрирують на фотоелектроколориметрі при червоному світлофільтрі або на спектрофотометрі при 595 нм у кюветі з робочою довжиною 1 см.

Для визначення активності α- амілази у конічну колбу на 100 см³ доливають 5 см³ фільтрату (ферментного препарату), додають на кінчику ножа сухого оцтовокислого кальцію та витримують протягом 15 хв у ультратермостаті або на водяній бані при 70 ºС (допускаються коливання температури не більше 0,5 ºС). Потім вміст колби швидко охолоджують під холодною водою. При такому прогріванні β- амілаза повністю інактивується, а α- амілаза зберігає свою активність. Далі визначення α- амілозної активності зводиться до описаної вище процедури.

Дію обох ферментів виражають у міліграмах гідролізованого крохмалю в умовах дослідження (за 30 хв або 1 год ) на 1 г борошна (проростків). Активність β- амілази визначають за різницею між сумарною активністю α- та β- амілаз та активністю α-амілази. Активність амілаз на 1 г борошна за 1 год. розраховують за наступною формулою :

x = (D-D₁) aV/ D н V₁ , (6.1)

де D- оптична густина контрольного розчину; D₁- оптична густина дослідного розчину; a- кількість внесеного крохмалю (60мг); н- маса наважки, г; V – об’єм початкової ферментної витяжки, см³; V₁ – об’єм витяжки, взятої для інкубірування, см³.