Определение общего микробного числа

Важным методом исследования микробиоценозов является определение общего микробного числа. Большое значение имеет определение этого показателя при санитарно-микробиологических, экологических исследованиях, в биотехнологии.

Общее микробное число (ОМЧ) – это общее количество микробов, содержащихся в единице объема или массы исследуемого объекта (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м 3 воздуха).

Существует три метода определения ОМЧ.

1. Оптический метод прямого подсчета бактерий под микроскопом в камере Горяева (используют при оценке работы очистных сооружений на водопроводных станциях).

2. Измерение биомассы (проводят в лабораториях предприятий биотехнологической промышленности)

3. Бактериологический метод (менее точный, но наиболее часто применяемый).

Бактериологическим методом выявляют определенную физиологическую группу бактерий, растущих при тех или иных условиях (термофильные, мезофильные, психрофильные, аэробные, анаэробные, факультативно анаэробные). Например, при культивировании на простых плотных питательных средах (МПА) при доступе кислорода воздуха и температуре 37^оС можно выявить рост группы мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ).

В настоящее время принято считать, что при использовании бактериологического метода ОМЧ – это общее количество видимых при двукратном увеличении мезофильных (имеющих температурный оптимум+37оС) аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (МАМ и ФАнМ), которые способны образовывать колонии на питательной среде при температуре +37оС в течение 24 ч. При обычных, стандартных исследованиях ОМЧ=КМАФАнМ.

Методика определения общего числа микроорганизмов омч (количества мафАнМ) бактериологическим методом

Основные этапы определения ОМЧ (КМАФАнМ) бактериологическим методом:

• гомогенизация образца,

• десорбция микроорганизмов с плотных частиц,

• приготовление разведений,

• посев на питательные среды,

• подсчет микробных колоний и идентификация выделенных культур.

Гомогенизацию образца проводят для равномерного распределения бактерий в анализируемом объекте. При исследовании проб различной консистенции, в зависимости от характеристик испытуемого материала, используют перемешивание простым встряхиванием или специальные приборы.

Десорбция бактерий с плотных частиц необходима для анализа объектов плотной консистенции. Для этого материал суспензируют в жидкости или с поверхности объекта берут смывы и отпечатки. При суспензировании к навеске образца массой 10 г (10 см³) добавляют 90 см³ воды и интенсивно перемешивают (вручную или в гомогенизаторе). В дальнейшем условно принимают 1 см³ полученной суспензии эквивалентным 0,1 г исходного материала.

Приготовление разведений чаще всего проводят, используя метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каждого последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего.

В стерильные пробирки с соблюдением правил асептики разливают по 9 см³ стерильной воды или специального раствора (физиологического раствора хлорида натрия, пептонной воды).

Из исследуемой пробы стерильной градуированной пипеткой отбирают 1 см³ жидкости (суспензии). Нельзя погружать пипетку в жидкость более чем на 3 мм во избежание в дальнейшем смывания микроорганизмов с ее наружной поверхности. 1 см³ жидкости (суспензии) переносят в пробирку с 9 см ³ жидкости для разведения. Получают разведение 1:10 (10^-1). Новой стерильной пипеткой(!) тщательно перемешивают содержимое пробирки путем многократного заполнения и опорожнения пипетки. Этой же пипеткой набирают 1 см³ исследуемой жидкости (суспензии) в разведении 1:10 и переносят во вторую пробирку с 9 см³ стерильной дистиллированной воды; получают разведение 1:100 (10^-2). Третьей стерильной пипеткой перемешивают содержимое второй пробирки и 1 см³ разведения вносят в третью пробирку с 9 см ³ жидкости для разведения; получают разведение 1:1000 (10^-3). Эти манипуляции повторяют до получения необходимого ряда разведений.

Рисунок 1

Посев на питательные среды проводят, используя методы глубинного и поверхностного посева.

а) Метод глубинного посева используют в случаях, когда идентификация микроорганизмов не требуется или же когда селекцию (выделение) той или иной группы микроорганизмов можно осуществить с помощью режима инкубации. В 2-3 и более пустые стерильные чашки Петри, соблюдая правила асептики, вносят по 1 см³ жидкой пробы, суспензии, а также приготовленного разведения. Чашки предварительно маркируют со стороны донышка, чтобы исключить их случайную замену при сдвиге. Не позднее чем через 15 мин после внесения материала в каждую чашку вливают по 10-12 см³ расплавленной и охлажденной до 45°С агаризованной питательной среды (МПА) так, чтобы толщина получившегося слоя была 4-5 мм. Вращательными движениями перемешивают расплавленную среду и посевной материал, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Чашки Петри оставляют на рабочем столе 10-15 минут для застывания. После застывания среды чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат для инкубирования. Оптимальным является, как правило, термостатирование при 37⁰С в течение 24-48 ч. Затем приступают к подсчету колоний, выросших на поверхности и в глубине агара.

б) Метод поверхностного посева.

В тех случаях, когда после подсчета колоний может возникнуть необходимость в выделении чистой культуры и ее идентификации для определения количества жизнеспособных микроорганизмов, используют метод поверхностного посева. Питательную среду разливают в чашки Петри и после застывания подсушивают, переворачивая чашки вверх дном и выдерживая их открытыми в термостате 30 мин при температуре 37^о С (или в ламинарном боксе 1-2 ч). В центр маркированной чашки Петри вносят заданное количество (чаще всего 0,1 или 0,2 см³) исследуемого жидкого материала или его разведения и немедленно равномерно распределяют по поверхности среды стерильным стеклянным или пластиковым шпателем до тех пор, пока на агаре не останется видимых следов жидкости. Чашки с посевами переворачивают, помещают в термостат, установленный на соответствующий температурный режим.

Подсчёт микробных колоний проводят сразу же после извлечения чашек из термостата, а если это невозможно, их хранят в холодильнике не более 24 ч. При подсчете колоний учитывают рост микроорганизмов только с заданными культуральными свойствами, а при использовании элективных сред – с соответствующими биохимическими характеристиками.

Колонии микроорганизмов подсчитывают визуально или при помощи лупы с 2-5-кратным увеличением. Чашку вверх дном кладут на черный лист бумаги, каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна чашки карандашом или маркером для стекла. Желательно оценивать только те разведения, при посеве которых на чашках вырастает от 30 до 300 колоний (а при посеве нативного материала – от 1 до 300 колоний). Если большое количество колоний трудно подсчитать, то с помощью стеклянной пластинки с сеткой со стороной квадрата 1 см подсчитывают колонии в разных местах чашки в 20 квадратах площадью 1 см², выводят среднее арифметическое в одном квадрате и умножают на площадь чашки в сантиметрах. В специализированных лабораториях используют специальные приборы - специальные ручки-счетчики, счетные камеры, счетчик колоний бактерий, с помощью которого подсчет колоний осуществляется за 0,2 сек. Результат определения КМАФАнМ выражают числом КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 см³ пробы.

Чтобы результаты выразить количеством микробов в 1 см³ исследуемого объекта или продукта, число выросших на чашке колоний умножают на степень разведения пробы и вычисляют среднее арифметическое количество колоний, подсчитанных на двух чашках.