Тема 11 санитарно-микробиологические методы бактериологического исследования почвы. Почвенные бациллы

Цель занятия.

1.Ознакомить студентов с основными биологическими свойствами санитарно-показательных микроорганизмов почвы.

2.Освоить методы санитарно-микробиологического исследования почвы.

3. Изучить биологические свойства бацилл и, в частности, возбудителя сибирской язвы.

Материалы и оборудование:

Набор готовых красок во флаконах в штативе, йодированный спирт, раствор Люголя, дистиллированная вода, предметные стекла, фильтровальная бумага, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными культурами в штативе. Микроскопы. Пробирки и чашки Петри с характерным ростом изучаемых микроорганизмов на питательных средах.

Методические указания.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Санитарную оценку почвы проводят по следующим показателям:

- определение ОМЧ в 1 г почвы;

- установление титра кишечной палочки (коли-титра);

- определение энтерококков (титра энтерококков);

- определение титра Clostridium perfringens;

- обнаружение патогенных микроорганизмов.

Для исследования отбирают образцы почвы из нескольких мест обследуемого участка на разной глубине (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб). На глубине 20-30 см пробы берут стерильным совком, из более глубоких мест – с помощью специального бура. Собирают общую пробу, тщательно перемешивают и 500 г этой смеси посылают в лабораторию.

Из навески почвы в количестве 30 г делают смыв стерильной дистиллированной водой 1:10 (270 см³), тщательно взбалтывают в течение 10 минут и отстаивают. Из этого разведения почвы готовят несколько последовательных разведений - до 1: 10 000 или 1:100 000 и выше, в зависимости от предполагаемой загрязненности почвы.

Для определения общего микробного числа из двух последних разведений берут по 0,1 см³ и заливают расплавленного и охлаждённого до 45°С питательного агара. Посевы инкубируют при 37°С, затем подсчитывают количество выросших колоний и определяют ОМЧ. Для обнаружения спорообразующих микроорганизмов смыв прогревают при 80°С 20 мин. и высевают на среды с последующим выращиванием в соответствующих условиях.

Коли-титр почвы определяют бродильным методом, используя среду Кесслера.для этого из каждого разведения почвы по одному мл переносят в пробирки со средой Кесслера и поплавком. На следующий день отмечают, в каких из пробирок появилось помутнение и пузырёк газа. В сомнительных случаях проводят пересев из таких пробирок на среду Эндо и выявляют кишечные палочки. Разведение, при котором появляется в последний разх помутнение и газ, и считается коли-титром.

Для определения энтерококков из разведений почвенной суспензии стерильной пипеткой берут 10 см³ и высевают во флаконы с 50 см³ элективной жидкой среды для энтерококков (щелочно-полимиксиновая энтерококковая среда и др.) После инкубирования (24 часа при 37°С) из среды накопления производят пересев петлей на одну из плотных элективных питательных сред, например МИС (молочно-ингибиторную среду). На этой среде энтерококки растут в виде черных выпуклых колоний с металлическим блеском или серых мелких колоний. Подтверждают принадлежность колоний к энтерококкам с помощью микроскопирования мазков и постановкой каталазного теста. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

При определении титра Clostridium perfringens по 1 см³ разведений почвы (до 1:1000 000), прогретой при температуре 75°С в течение 20 мин для исключения вегетативных форм, вносят в два параллельных ряда пробирок. Затем по стенке пробирок, избегая образования пузырьков воздуха, наливают по 9-10 см³ железосульфитного агара или среды Вильсона-Блера, предварительно расплавленных на водяной бане и остуженных до 45-50°С. Для создания анаэробных условий роста пробирки быстро охлаждают, помещая в холодную воду. Посевы инкубируют при 45°С. В среде Вильсона-Блера и железосульфитном агаре клостридии растут в глубине столбика среды, образуя черные колонии. Накапливающиеся в среде газы разрывают агар. Наибольшее разведение почвенной взвеси, которое дает в питательной среде размножение Clostridium perfringens, считают титром этого микроба в почве.

Иногда проводят определение в почве количества термофильных бактерий, актиномицетов и грибов, определение токсичности почв по отношению к микроорганизмам, определение колифагов и другие исследования. Санитарно-микробиологическую оценку почвы производят по комплексу показателей.