Тема 6 аэробные микроаэрофильные палочки и кокки семейств псевдомонады и ацетобактерии

Цель занятия

4. Ознакомить студентов с основными биологическими свойствами микроорганизмов групп псевдомонады и ацетобактерии.

5. Изучить морфологию коринебактерий и микобактерий, особенности культивуироования

6. Ознакомить студентов со схемой исследования материала на наличие микобактерий – возбудителей туберкулёза.

Материалы и оборудование: Набор готовых красок во флаконах в штативе, йодированный спирт, раствор Люголя, дистиллированная вода, предметные стекла, фильтровальная бумага, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными культурами в штативе. Микроскопы. Пробирки и чашки Петри с характерным ростом изучаемых микроорганизмов на питательных средах.

Методические указания.

Семейство Pseudomonodaceae относится к отделу Gracilicutes, группе 4 определителя Берджи - Грамотрицательные, аэробные микроаэрофильные палочки и кокки. Это подвижные прямые или изогнутые палочки, никогда не образующие спор. Большинство - строгие аэробы, хемоорганотрофы, для которых характерны процессы окисления и никогда - брожения. Встречаются факультативно анаэробные и факультативно хемолитотрофные формы. Среди представителей этого семейства есть ацидофильные бактерии - представители рода Frateria, фитопатогенные бактерии (род Xanthomonas) и патогенные для человека и животных (Pseudomonas aeruginosa). Имеются виды бактерий, обладающие энтомопатогенными свойствами (патогенностью для насекомых), антибиотической активностью. Типичные представители объединены в род Pseudomonas.

Род Pseudomonas - псевдомонады.

Псевдомонады - большое количество микроорганизмов, из которых описано 29 видов. Все псевдомонады - мелкие, палочковидные, подвижные клетки, несущие от 1 до 7,чаще 2-3 жгутика. Жгутики всегда располагаются полярно. Размножаются клетки в основном делением. Встречаются пигментные и бесцветные формы.

Псевдомонады - очень неприхотливые микроорганизмы, большинство из них не нуждаются в специальных ростовых факторах и растут на простых минеральных средах, могут колонизировать различные влажные поверхности. Температурные границы их распространение от 4 до 40°С. Большинство псевдомонад безобидные сапротрофы, но встречаются виды патогенные и условно патогенные для высших организмов.

Pseudomonas aeruginosa - синегнойная палочка - патогенный в отношении человека и животных микроорганизм, возбудитель синегнойной инфекции. Обычно развивается на ослабленных организмах, вызывая экземы, отиты, циститы, пневмонию, менингоэнцефалит, осложняет заживление ран, ожогов. Очень неприхотлив, растёт даже в физиологическом растворе NаС1. также колонизирует различные поверхности, в том числе водопроводные краны, раковины, инструменты, образуя биоплёнку. Синегнойная палочка обладает феноменальной устойчивостью к дезинфицирующим веществам, может расти на поверхности мыла, в растворе фурацилина. При росте на жидких и плотных питательных средах МПБ, MПА) выделяет специфический сине-зелёный пигмент – пиоцианин), а также может выделять желто-зеленый пигмент - пиовердин (флюоресцеин); иногда - красный пигмент - пиорубин и черно-коричневый пигмент - пиомеланин. В результате культуры синегнойной палочки обычно окрашиваются в зеленоватый цвет, и издают запax «замляничного мыла» или «жасмина». На МПБ колонии синегнойной палочки - плоские, расплывчатые, врастающие в среду, с неровными краями. На МПБ синегнойная палочка образует помутнение, зелёный пигмент, обильный рыхлый осадок и серебристую плёнку на поверхности.

Дифференцирующий тест для культуры Pseudomonas aeruginosa - тест с хлороформом. Если в бульонную культуру синегнойной палочки внести 10,5-1,0 мл хлороформа, он окрасится в зеленовато-голубой цвет за счёт растворимого в нём пиоцианина и опустится на дно пробирки.

Синегнойные палочки обладают выраженной протеолитической активностью, расщепляют белки. В то же время их сахаролитическая активность - слабая, они окисляют в аэробных условиях- глюкозу и арабинозу и поэтому относятся к условной группе «неферментирующих» микроорганизмов.

Pseudomonas fluorescens - флюоресцирующая палочка - характерный представитель флюоресцирующих псевдомонад. Рост флюоресцирующей палочки на питательных средах напоминает рост P.aeruginosa, однако при этом не выделяется пигмент пиоцианин, хотя и образуется зеленовато-жёлтый флюоресцеин. Тест с хлороформом - отрицательный. Флюоресцирующая палочка, в отличие от сине-зелёной палочки является психрофилом (растёт, в отличие от синегнойной палочки, при 4°С). Это очень широко распространенная в природе бактерия играет важную роль в очистке окружающей среды от органических веществ, образующихся в процессе жизнедеятельности человека. Постоянно присутствует на теле и в организме рыбы. В биотехнологической промышленности флюоресцирующая палочка используется для получения витаминов группы «В».

Pseudomonas putida - гнилостная палочка. Наряду с флюоресцирующей палочкой очень широко распространена в природе и также является психрофилом. Отличается от других псевдомонад по некоторым биохимическим свойствам. Наряду с другими сапрофитами принимает активное участие в процессах гниения.

Pseudomonas suringae вызывает увядание растений. В процессе жизнедеятельности эта бактерия продуцирует полисахарид, который закупоривает сосуды в листьях растений.

СХЕМА ИДЕНТИФИКАЦИИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Этапы иссле-дования	Патологический материал (гной, соскобы эпителия, мазки из ран, моча при цистите, молоко при мастите, фекальные массы при энтерите, кровь при сепсисе; кусочки паренхим. органов; пищевые продукты)
1 этап	Мазок (палочки, Гр-, Сп-, Капс.-, подвижные, Располагаются одиночно, беспорядочно и попарно	Посев на: простые среды: МПА, МПБ, кровяной агар, а также на элективные среды для энтеробактерий – Эндо, Левина
2	Изучение культурально-биохимических свойств Плоские, сливающиеся, сочные колонии с изрезанными краями, поверхность колоний часто имеет матовый отблеск - «радужный лизис». Лактоза «-». Выделяющийся пигмент пиоцианин в большинстве случаев окрашивает колонии и среду под ними в зеленоватый цвет) При росте выделяется характерный запах «жасмина» или «земляничного мыла» Гемолитическая активность на кровяном МПА +
3	Дополнительное биохимическое тестирование Оксидазиая активность + (меняется цвет реактива на оксидазу) Качественная реакция на пиоцианин с хлороформом + Рост при 42оС и отсутствие роста при 4°С Окисление глюкозы только в аэробных условиях
4	Биопроба (изредка) на кроликах, белых мышах +; Серологическая диагностика

Семейство Acetobacteriaceae

Род Gluconobacter - глюконобактерии.

По форме клеток бактерии рода Gluconobacter единственного вида G. oxidans очень близки к бактериям рода Pseudomonas (синегнойной палочке).Это микроорганизмы, у которых очень слабая протеолитическая активность и высокая требовательность к питательному субстрату. Поэтому они не врастут на универсальных средах (МПА). Для них характерны окислительный тип метаболизма. Отличительной чертой этой группы бактерий является осуществление процессов неполного окисления, когда в среде накапливаются продукты, окисленные частично, уксусная, глюконовая, фумаровая, молочная, различные кетокислоты. Распространены на растениях, богатых углеводами, в нектаре, вииограде, зрелых фруктах, овощах, в мёде, на пчёлах.

Бактерии рода Gluconobacter используются в промышленности для получения полусинтетического витамина С. Глюконовые кислоты, образуемые бактериями, обладают бактерицидным действием и используются в качестве препаратов для предотвращения послеоперационных осложнений. В парфюмерной промышленности применяется диоксиацетон - продукт неполного окисления глицерина, получаемый также с помощью глюконовых бактерий.

Род Acetobacteraceae - ацетобактерии, уксуснокислые палочки.

Ацетобактерии (уксуснокислые палочки) - бактерии, способные к полному окислению органических субстратов до СО₂ и Н₂О. В этом случае образовавшаяся уксусная кислота представляет собой лишь промежуточный этап, и после исчерпания из среды исходного субстрата бактерии начинают медленно окислять её. Бактерии этой группы объединены в род Acetobacter, типичным представителем которого является A. aceti. Это мелкие, короткие, подвижные, грамотрицательные палочки, облигатно аэробные организмы, устойчивые к повышенным концентрациям спирта и уксусной кислоты. Иногда встречаются разветвленные формы или клетки соединены в длинные извилистыё цепочки. Отдельные представители (А.peroxydans, A. Rancens, А. pasteurianum) отличаются друг от друга морфологически и физиологически. Ацетобактерии менее требовательны к питательным средам, чем бактерии рода Gluconobacter. На обогащенном МПА образуют блестящие жёлтые колонии.

Ацетобактерии широко распространены в природе. Их можно обнаружить в нектаре цветов, на ягодах, сладких фруктах. В прокисших соках, пиве, вине, квашеных овощах уксуснокислые бактерии растут на поверхности, образуя серовато-белую плёнку. Специфическими переносчиками уксуснокислых бактерий служат маленькие красноватые мушки Drosophyla (дрозофилы), в большом количестве встречающиеся там, где имеются плодовые отбросы. Уксуснокислые бактерии часто развиваются вслед за дрожжами, используя продукт спиртового брожения как субстрат для роста.

Уксуснокислые бактерии используются в промышленности для получения натурального спиртового уксуса (продуцент Acetobacter aceti), винного уксуса (из вина) и яблочного уксуса (из яблочного сока). Также они являются вредителями спиртового, пивоваренного, консервного производств, виноделия, производства безалкогольных напитков. При развитии в пиве, вине, хлебном тесте вызывают скисание и порчу продуктов. A. xylinum — это единственный прокариотический организм, который синтезирует растительную целлюлозу. Ацетобактерии входят в состав, кефирного грибка, кумысной закваски, чайного гриба, придавая соответетвующим пищевым продуктам полезные для здоровья свойства. Они выделяют антибиотикоподобные вещества, подавляющие жизнедеятельность кишечных и гнилостных микроорганизмов.

Чайный гриб.

Представляет собой прочный пищевой симбиоз бактерий A. xylinum, G. oxydans и дрожжевых грибов. Слоевище гриба образует A. xylinum. В нижней части, в темноватых пластах обитают дрожжи, а в верхней, покрытой целлюлозной оболочкой, - G. oxydans. Для культивирования чайного гриба необходима заварка чая с добавлением сахара. Чай - источник биологически активных веществ, сахароза - единственный источник углеродного питания. Фермент чайного гриба левансахараза расщепляет сахарозу до гексоз. Гексозы частично используются бактериями G. oxydans, а частично дрожжами, которые при этом накапливают витамины и этиловый спирт, потребляемый уксуснокислыми бактериями A. xylinum. Культуральная жидкость чайного гриба представляет собой целебный напиток, содержащий глюконовую, 2,5-оксиглюконовую кислоты. Его рекомендовала тибетская медицина при лечении заболеваний желудка, горла и т.д.

Практическая работа.

1. Приготовить мазок из культуры Pseudomonas, окрасить по Граму. Изучить особенности морфологии. Сделать зарисовку.

2. Изучить культуральные свойства Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens на жидких и плотных питательных средах.

3. Провести тест на хлороформ. Для этого в пробирки с культурами синегнойной и флюоресцирующей палочек на жидкой питательной среде внести 0,5-1,0 мл хлороформа и встряхнуть. При наличии пиоцианина (то есть росте синегнойной палочки) хлороформ окрашивается в голубой цвет и опускается на дно пробирки.

4. Приготовить препарат на предметном стекле из молодого слоевища «чайного гриба» в капле раствора Люголя, под покровным стеклом. Микроскопировать. Сравнить окраску бактерий (бактерии рода Acetobacter окрашиваются в желтоватый цвет, a Gluconobacter - в фиолетовый). Сделать зарисовки.

5. Провести посевы на специальные питательные среды проб молочных продуктов с целью получения чистой культуры для следующего занятия.