2.2.5. Разложение микроорганизмами природных высокополимерных органических соединений

Большинство потенциальных субстратов для роста и развития микроорганизмов представляют собой нерастворимые природные органические полимеры, такие как целлюлоза, гемицеллюлоза, пектиновые вещества, хитин, хитозан, глюканы, лигнин. Способы их разложения различными микроорганизмами основаны на ряде общих принципов:

• деградация биополимеров осуществляется при совместном участии различных микроорганизмов, синтезирующих те или иные необходимые экзоферменты, относящиеся в большинстве случае к гидролитическим;

• начальное расщепление биополимеров под действием экзоферментов – это стадия, лимитирующая скорость их использования и тем самым рост микроорганизмов;

• последующий метаболизм растворимых продуктов гидролиза биополимеров состоит из двух этапов – окислительного и восстановительного.

Рассмотрим механизмы использования микроорганизмами наиболее распространенных биополимеров – основных питательных субстратов для бактерий.

Разложение целлюлозы

Целлюлоза – основной полисахарид растительных клеток, входящий в состав клеточных стенок. Из всех органических субстратов целлюлоза присутствует в природе в наибольшем количестве. Молекула целлюлозы представляет собой линейный гомополисахарид, состоящий примерно от 100 до 10 000 остатков глюкозы, соединенных β-1,4-гликозидными связями, которые обеспечивают ее высокую прочность. В полимерной цепи целлюлозы каждый остаток глюкозы повернут относительно соседнего на 180°; такую повторяющуюся пару остатков целлюлозы называют целлобиозой. Целлюлозные цепи, связанные между собой многочисленными межмолекулярными водородными связями, формируют ригидные и нерастворимые в воде фибриллы. Фибриллы содержат как высокоупорядоченные участки (плотно упакованные цепочки макромолекул), которые называются кристаллическими, так и аморфные, рыхлые (некристаллические) участки. Некристаллические участки фибрилл целлюлозы подвергаются воздействию гидролитических ферментов микроорганизмов, тогда как кристаллические участки высокоустойчивы к их действию.

Разложение целлюлозы осуществляют различные представители бактерий, грибов и простейших. Все эти микроорганизмы называются целлюлозолитическими. К целлюлозолитическим грибам относятся представители родов Fusarium, Chaetomium и Neocallimastix, а также виды Trichoderma viride, Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Myrothecium verrucaria. Разложение целлюлозы осуществляют простейшие родов Diplodinium, Eudiplodinium, Entodinium. К целлюлозолитическим бактериям относятся как аэробные, так и анаэробные виды. Аэробное расщепление целлюлозы осуществляют представители родов Cytophaga, Sporocytophaga, Polyangium, Sporangium, Bacillus, Actinomyces, Alcaligenes, Cellulomonas, Pectobacterium, Erwinia, Microbispora, Pseudomonas, Streptomyces и Thermomonospora. В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют представители родов Bacteroides, Butyrivibrio, Clostridium, Fibrobacter, Thermoanaerobacter и Ruminococcus. Следует отметить, что только немногие из пречисленных микроорганизмов синтезируют полный набор ферментов, необходимых для эффективного разложения целлюлозы. Большинство целлюлозолитических организмов способны продуцировать только некоторые ферменты, участвующие в этом процессе, и, вероятно, используют целлюлозу в ассоциации с другими микроорганизмами.

Разложение целлюлозы с помощью микроорганизмов проходит в несколько этапов. Ферментная система, осуществляющая разложение целлюлозы до глюкозы, носит название целлюлазного комплекса. В его состав входят по меньшей мере три фермента: эндо-β-1,4-глюканаза, экзо-β-1,4-глюканаза и β-глюкозидаза. Процесс расщепления целлюлозы протекает следующим образом: под действием фермента эндо-β-1,4-глюканазы происходит разрыв различных β-1,4-гликозидных связей внутри макромолекулы с образованием больших фрагментов со свободными концами. Затем под влиянием экзо-β-1,4-глюканазы от концов образованных фрагментов отщепляются дисахариды целлобиоза. β-глюкозидаза осуществляет гидролиз целлобиозы с образованием 2 молекул глюкозы. При аэробном разложении целлюлозы глюкоза далее окисляется в основном до СО₂ и Н₂О. Могут также накапливаться в небольших количествах органические кислоты. При анаэробном распаде целлюлозы первоначальный продукт ее гидролиза – глюкоза подвергается сбраживанию, в результате чего образуются различные органические кислоты (уксусная, молочная, муравьиная, масляная, янтарная), этанол, СО₂, Н₂. Состав продуктов брожения отличается у разных видов микроорганизмов. Примером анаэробного сбраживания целлюлозы являются микробиологические процессы, которые осуществляются в рубце жвачных животных. Рубец жвачных – это своеобразная бродильная камера; благодаря его функции животное, лишенное собственных ферментов целлюлаз и гемицеллюлаз, может эффективно усваивать растительный материал. Рубец можно также рассматривать как аналог полностью анаэробного ферментера с полунепрерывным потоком. Молекулярный кислород может проникать в рубец в следовых количествах с пищей, но после этого он немедленно потребляется. В рубце содержится большое количество микроорганизмов. В состав микробиоты рубца входят строго анаэробные бактерии (10¹⁰ – 10¹¹ клеток/г) и анаэробные инфузории, относящиеся к родам Diplodinium и Entodinium (10⁴ – 10⁶ клеток/г). В разложении полимеров в некоторой степени частично участвуют анаэробные грибы (10² – 10⁴ зооспор/г). Среди прокариот рубца идентифицировано более 200 видов, принадлежащих к целлюлозолитическим, пектолитическим, молочнокислым, маслянокислым, пропионовокислым и метаногенным бактериям. Общий состав микробиоты рубца довольно стабилен и разнообразен; ни один вид микроорганизмов не составляет более 3 % общей численности микробных клеток. В рубце созданы идеальные условия для роста и развития микроорганизмов: во-первых, они обеспечены питательной средой, которая в изобилии содержит сбраживаемые углеводы и хорошо забуферена слюной; во-вторых, они находятся в условиях постоянной благоприятной температуры – температуры тела животного; в-третьих, в желудке поддерживаются оптимальные условия влажности; в-четвертых, осуществляется постоянное перемешивание субстрата и отток непереваренных остатков корма и метаболитов в нижележащие отделы пищеварительного тракта. Это позволяет расщеплять растительную пищу с высоким содержанием (до 85 % сухого веса) клетчатки примерно за двое суток. Микроорганизмы рубца расщепляют целлюлозу и другие сложные углеводы, присутствующие в поглощенном животном корме, образуя жирные кислоты и газы. Суммарный микробиологический процесс, происходящий в рубце, можно представить следующим уравнением:

100 Глюкоза → 113 Ацетат + 35 Пропионат + 26 Бутират +

+ 104 СО₂ + 61 СН₄ + 43 Н₂О

Как видно из уравнения, в рубце отсутствует молочная кислота (основной продукт молочнокислого брожения), так как пропионовокислые бактерии сбраживают ее с образованием пропионата, ацетата, Н₂ и СО₂. Следует отметить, что метан не является прямым продуктом разложения целлюлозы: он имеет вторичное происхождение и образуется из жирных кислот, СО₂ и Н₂. Образующиеся жирные кислоты всасываются через слизистую оболочку рубца, поступают в кровоток и, циркулируя с кровью, достигают различных тканей тела, где они используются в процессе дыхания. От образующихся в рубце газов жвачные животные избавляются путем частого отрыгивания. Бактерии рубца изменяют также растительные жиры, подвергая их гидрированию, в результате чего образуются насыщенные жирные кислоты, которые всасываются в кишечнике, а затем включаются в собственные жиры организма крупного рогатого скота, входящие в состав мяса, молока и масла. Жиры, благодаря этому, становятся более тугоплавкими и имеют более низкую температуру плавления. Жиры же нежвачных млекопитающих содержат ненасыщенные жирные кислоты с более короткой углеродной цепью, поступающие с растительным кормом, и не гидрируются. Микробная популяция рубца быстро растет, и клетки микроорганизмов переходят из рубца вместе с непереваренным растительным материалом в следующие отделы пищеварительного тракта животного. В самом рубце пищеварительные ферменты не образуются, но в других отделах выделяются протеазы, которые разрушают и переваривают микробные клетки, поступающие из рубца. Образующиеся при этом азотистые соединения и витамины используются животным. По этой причине потребности в соединениях азота у жвачных животных реализуются значительно проще, чем у остальных групп млекопитающих. Они могут существовать, используя в качестве источника азота мочевину или аммиак, которые у большинства млекопитающих являются продуктами выделения.

Таким образом, рубец жвачных животных можно рассматривать в качестве примера взаимовыгодного (мутуалистического) симбиоза или системы активной кооперации между хозяином и микроорганизмами.

Ферменты целлюлазы, продуцируемые целлюлозолитическими микроорганизмами, используются для модификации целлюлозы путем частичного гидролиза. Их применяют для обработки соломы, используемой в качестве субстрата при выращивании грибов, для осветления фруктовых и овощных соков, в пивоварении, при производстве текстиля, получении бумажной пульпы и очистке сточных вод в целлюлозной промышленности.