2.1.2. Методы осаждения белков

Исследуемый материал: экстракт дрожжевого белка.

Реактивы:		Оборудование
1. Растворы 5 н HCl и 1 н HCl;		1.Обеззоленные бумажные фильт-
2. раствор 50% (масса/объём) трихлоруксусной кислоты (ТХУ);		ры (плотные); 2. водяная баня;
3. ацетон или этиловый спирт;		3. термометр;
4. сульфат аммония (NH4)2SO4 кристаллический;		4. центрифуга; 5. центрифужные стаканы;
5. раствор 6% CuSO4;		6. магнитная мешалка;
6. раствор 1,25% NaOH;		7. пробирки химические;
7. раствор 5% BaCl2;		8. стаканы химические;
8. все реактивы для метода Несслера;		9. мерные цилиндры на 25 и 100
9. все реактивы для метода Лоури.		см3;
		10. конические колбы на 200 см3;
		11. пипетки на 1, 2 и 5 см3;
		12. воронки химические;
		13. бумажный универсальный индикатор;
		14. весы аналитические;
		15. вакуум-сушильный шкаф;
		16. всё оборудование для метода Несслера;
		17. всё оборудование для метода Лоури.

Техника проведения эксперимента. Перед проведением всех реакций осаждения раствор белка предварительно нейтрализуют 5 н HCl по универсальному индикатору до слабокислой реакции (рН около 5,0). Определяют концентрацию белка по методу Лоури или микрометоду с помощью биуретовой реакции.

Осаждение белка по Барнштейну.

К 5 см³ раствора белка приливают сначала 2,5 см³ 6% CuSO₄, а затем при перемешивании 2,5 см³ 1,25% NaOH. Через 15-20 мин. после отстаивания осадка содержимое пробирки сливают через маленький бумажный фильтр (предварительно высушенный и взвешенный). Осадок на фильтре промывают тёплой дистиллированной водой до отрицательной реакции на хлористый барий (капля промывных вод, смешанная с каплей раствора BaCl₂ на стекле не должна давать помутнения).

Выход белка можно определить весовым методом путём взвешивания фильтра с осадком после доведения до постоянной массы при 80⁰С в вакуум-сушильном шкафу при остаточном давлении 0,5 атм.

Второй способ определения белка более точный. Фильтр с осадком сжигают с 2 см³ H₂SO₄, как описано в разделе 4, и определяют азот (а затем белок) по методу Несслера.

Вычисление результатов. Выход белка при осаждении (весовой метод) определяется по формуле:

(2.1.1.)

где х₁ – вес бумажного фильтра, мг.;

х₂ – вес фильтра с бумажным осадком, мг.;

с – концентрация белка в исходном растворе белка, мг/см³;

20 – числовой коэффициент, учитывающий все пересчёты.

При втором способе расчёт производят по формуле:

(2.1.2)

где N – количество общего азота в сожжённом белковом осадке, мкг.;

с – концентрация белка в исходном растворе белка, мг/см³;

0,125 – числовой коэффициент, учитывающий все пересчёты.

Осаждение белка нагреванием.

Пробирку с 5 см³ раствора белка помещают на водяную баню с начальной температурой 40⁰С и начинают постепенно нагревать исследуемый раствор. Уже при 50⁰С начинается помутнение раствора, а при 60-70⁰С происходит выделение отдельных хлопьев белка, которое увеличивается при 80⁰С. При достижении 90-95⁰С денатурацию белка можно считать завершённой. После охлаждения смеси осадок отделяют фильтрованием и определяют выход белка как и в предыдущих двух случаях по формулам (2.1.1.) и (2.1.2.).

Фракционное осаждение белков сульфатом аммония (высаливание)

Растворимость соли (NH₄)₂SO₄ при 20⁰С составляет 75,4 г в 100 см³ воды, или 52,8 г в 100 см³ раствора. При этой концентрации (52,8% или 4 М) насыщение раствора сульфата аммония составляет 100%.

Поскольку глобулины высаливаются при насыщении 50% (т.е. концентрация (NH₄)₂SO₄ 26.4% или 2 М), то в химический стакан с 20 см³ раствора белка при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 10-15 мин. постепенно добавляют 5,28 г (NH₄)₂SO₄. Образовавшийся осадок глобулинов отделяют центрифугированием при 6 тыс. об/мин. в течение 10 мин. Супернатант, содержащий альбумины, сливают в химический стакан и добавляют при перемешивании ещё 5,20 г (NH₄)₂SO₄ до насыщения 100%. Выпавший осадок альбуминов также отделяют центрифугированием при 6 тыс. об/мин. в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают.

Осадки альбуминов и глобулинов растворяют в 10 см³ дистиллированной воды каждый), глобулины растворяются в воде, поскольку в воде остаётся часть соли (NH₄)₂SO₄). Содержание белка в обоих растворах определяют по методу Лоури, как описано в разделе 6.

Определяют суммарный выход белков при осаждении этим методом и процентное соотношение альбуминов и глобулинов в дрожжевых белках.

Осаждение белка трихлоруксусной кислотой.

К 10 см³ раствора белка приливают осторожно (по каплям и с постоянным перемешиванием) 1-1,5 см³ 50% ТХУ. Через 30 мин. после формирования осадка его отделяют центрифугированием при 6 тыс. об/мин. в течение 10 мин. Осадок растворяют в 10 см³ реактива А и определяют содержание белка в растворе по микрометоду, как описано в разделе 1.6.3.

Осаждение белка ацетоном (этиловым спиртом).

В коническую колбу на 200 см³ помещают 30 см³ раствора (нейтрального) дрожжевых белков и добавляют 120 см³ охлаждённого ацетона (этилового спирта). Колбу оставляют в холодильнике не менее чем на час, для формирования осадка.

Осадок отделяют от надосадочной жидкости декантированием или центрифугированием при 4-5 тыс. об/мин. в течение 5 мин. и растворяют в 20 см³ дистиллированной воды (глобулины также растворяются, т.к. в ацетоновом осадке есть соли).

Полученный раствор дрожжевых белков используют для фракционирования альбуминов и глобулинов с помощью диализа против дистиллированной воды.