- •Министерство образования
- •Российской Федерации
- •Московский Государственный Университет
- •Пищевых Производств
- •Методические указания
- •Раздел 2. Биохимические основы синтеза белков и биологически
- •Часть I. Белки.
- •Диализ и реакции осаждения''………………………………………………24
- •IV. Лабораторная работа 4.
- •Введение
- •Лабораторная работа 1. ''Определение содержания ''сырого протеина'' и определение истинного белка в дрожжах. Выделение белков из дрожжей''. План работы.
- •Выделение белков из биомассы микроорганизмов.
- •Гомогенизация и дезинтеграция.
- •Обезжиривание.
- •Экстракция белков.
- •1.2. Принцип выделения белков из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
- •1.3.Определение содержания влаги в образцах. Ускоренный метод с использованием прибора Чижовой.
- •Метод высушивания до постоянной массы.
- •1.4. Определение общего азота
- •Данные для приготовления стандартных растворов
- •1.5. Определение ''сырого протеина''
- •1.6. Определение белка
- •1.6.1. Определение белка по ультрафиолетовому поглощению
- •1.6.2.Определение белка по методу Лоури
- •Данные для приготовления стандартных растворов белка
- •1.6.3. Микрометод определения белка с помощью биуретовой реакции
- •Лабораторная работа 2. ''Изучение некоторых физико-химических свойств дрожжевых белков. Диализ и реакции осаждения.'' План работы.
- •2.1. Осаждение белков.
- •2.1.1.Обратимое и необратимое осаждение белков.
- •2.1.2. Методы осаждения белков
- •2.2. Фракционирование белков с помощью диализа.
- •3.1. Фракционирование белков методом колоночной гель-хроматографии.
- •2. Сефадекс г – 100. Приготовление геля для гель-хроматографии и заполнения колонки.
Лабораторная работа 2. ''Изучение некоторых физико-химических свойств дрожжевых белков. Диализ и реакции осаждения.'' План работы.
1. Белки, осаждённые ацетоном, перерастворить, определить концентрацию белка в растворе по методу Лоури или микрометодом с помощью биуретового реактива. Поставить на диализ до 3 занятия (раздел 2.2.).
2. Провести реакции осаждения белка в исходном экстракте из дрожжей различными способами. Во всех случаях рассчитать выход белка (раздел 2.1.).
3. Построить калибровочную кривую для определения белка по методу Лоури или микрометоду с помощью биуретового реактива (раздел 1.6.2.).
2.1. Осаждение белков.
Существует большое число различных реакций осаждения белков. Наиболее характерным высоко специфичным осадителем белка является трихлоруксусная кислота CCl3COOH (ТХУ). Осаждение с помощью ТХУ может служить одним из критериев принадлежности биополимера к белкам.
2.1.1.Обратимое и необратимое осаждение белков.
Реакции осаждения могут быть обратимыми и необратимыми. Это зависит от применяемого осадителя.
При обратимом осаждении белки не подвергаются глубоким изменениям, и полученные осадки могут быть перераспределены в первоначальном растворителе. Обратимое осаждение белков получают при использовании нейтральных солей: (NH4)2SO4, NaCl, MgSO4 и др., при этом белки сохраняют свои биологические функциональные свойства. К органическим растворителям относятся: ацетон, изопропиловый спирт, этиловый спирт (при не очень длительном воздействии) и некоторые другие соединения. С помощью этих осадителей можно разделить белки на отдельные фракции. Примером может служить осаждение белков сернокислым аммонием. При постепенном добавлении (NH4)2SO4 в раствор до концентрации 2 М в осадок выпадают глобулины, их отделяют дальнейшим центрифугированием. При добавлении (NH4)2SO4 до концентрации 4 М в осадок выпадают альбумины.
При необратимом осаждении белки подвергаются глубоким изменениям и потом не перерастворяются, происходит денатурация белков, они утрачивают как функциональные, так и физико-химические свойства. Примером денатурации может служить тепловая денатурация яичного белка при нагревании.
Кроме кипячения необратимые реакции осаждения белка могут быть вызваны солями тяжёлых металлов (ртути, меди, свинца, серебра и др.), минеральными и органическими кислотами. Все минеральные кислоты, кроме ортофосфорной, осаждают белки при определённой концентрации, но затем опять их растворяют (кроме азотной кислоты).
Полное и быстрое осаждение белков происходит при достижении раствором изоэлектрической точки. Изоэлектрическая точка белка – такое значение рН, при котором молекула белка электронейтральна (диссоциация карбоксильных групп уравновешена диссоциацией аминогрупп, и суммарный электрический заряд молекулы белка равен нулю).
В изоэлектрической точке или при значениях рН близких к ней, белки имеют наименьшую растворимость. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (рН около 5,0).