Данные для приготовления стандартных растворов белка

№ пробы	Исходный стандартный раствор, см3	Вода, см3	Реактив Д, см3	Реактив Е, см3	Количество белка в см3 рабочего стандартного раствора, мкг	Экстинция при 750 нм
						Е1	Е2	Е3
К	0	1	5	0,5	0
1	0,05	0,95	5	0,5	10
2	0,10	0,90	5	0,5	20
3	0,20	0,80	5	0,5	40
4	0,40	0,60	5	0,5	80
5	0,60	0,40	5	0,5	120
6	0,70	0,30	5	0,5	140
7	1,00	0	5	0,5	200

Для большей достоверности при построении калибровочной кривой готовят три параллельных серии рабочих стандартных растворов. И, соответственно, для каждой концентрации белка получают три значения экстинкции, которые вносят в таблицу 2 .

На основе полученных данных строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают концентрацию белка в мкг/см³, на оси ординат – экстинкции. Полученные точки соединяют прямой, выходящей из точки пересечения осей.

Построение калибровочной кривой и расчёт коэффициента пропорциональности проводят аналогично описанному в разделе 4. При дальнейшем использовании калибровочной кривой расчёт результатов проводят по формуле: .

1.6.3. Микрометод определения белка с помощью биуретовой реакции

Принцип метода. Этот метод может быть использован в присутствии ДНК. ДНК в концентрации до 0,7 мг/см³ в реакционной смеси не мешает определению, т.е. допустимо соотношение ДНК : белок ≥ 10 : 1.

Белок сначала обрабатывается биуретовым реагентом, а затем реактивом Фолина. Окраска развивается менее чем за 7 мин. и сохраняет стабильность 2,5 ч. (для семи изученных белков); в случае лизоцима наблюдалось за это время падение интенсивности окраски на 11%. Чувствительность составляет 1/16 чувствительности метода Лоури, но существенное преимущество состоит в том, что зависимость поглощения от количества белка линейна, а влияние природы белка менее существенно. На реакцию не влияет присутствие в растворе NaCl (1,5 М), ацетата натрия (0,1 М). При концентрации мочевины больше 2,0 моль/дм³ требуется ввести небольшую поправку на поглощение мочевины.

Реактивы:

1. 0,21% раствор CuSO₄ 5 H₂O в 30% NaOH. Чтобы предупредить выпадение осадка гидроксида меди этот раствор готовят следующим образом: 21 см³ 1% (масс./об) водного раствора CuSO₄ 5 H₂O добавляют к 75 см³ 40% NaOH, а затем уже разбавляют водой до 100 см³ – реактив А.

2. 30% NaOH – реактив Б.

Техника проведения эксперимента. К 2 см³ раствора белка (0,02-0,53 мг/см³) добавляют 1 см³ реагента А. Тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 мин., после чего измеряют поглощение при 310 нм против ''холостого'' опыта. Готовят следующие смеси:

Х₁ – 2 см³ раствора белка + 1 см³ реактива А;

Х₂ – 2 см³ дистиллированной воды + 1 см³ реактива А;

Y₁ – 2 см³ раствора белка + 1 см³ реактива Б;

Y₂ – 2 см³ дистиллированной воды + 1 см³ реактива Б.

Поглощение белка равно (Х₁ – Х₂) – (Y₁ – Y₂); используют градуировочный график.