1.6.2.Определение белка по методу Лоури

Принцип метода. Метод основан на двух реакциях, приводящих к образованию сине-фиолетовой окраски. Первая реакция – образование биуретового комплекса при действии на белок сернокислой меди в щелочном растворе. Биуретовую реакцию способны давать вещества, содержащие не менее двух пептидных связей.

Для пептидной связи характерна кето-енольная таутомерия:

H

│

─ C ─ N ─ ─ C = = N ─ (1.6.3.)

║ │

O O

кето-форма енольная форма

Реакция образования полипептидной цепью биуретового комплекса протекает по следующей схеме:

R_{1 (4)} O O R_{3 (6)}

│ │ ║ │

2 …─ NH ─ CH ─ C ═ N ─ CH ─ C ─ N ─ CH ─ C ─ …

│ ║

R _{2 (5)} O

+ Cu(OH)₂

– 4 H₂O

+ 2 NaOH

R₁ O^– O R₃

│ │ ║ │ 2^–

… ─ NH ─ CH ─ C ═ N ─ CH(R₂) ─ C ─ N ─ CH ─ C ─ …

║

O (1.6.4.)

Cu

2 Na⁺

O

║

… ─ NH ─ CH ─ C ─ N ─ CH(R₅) ─ C ═ N ─CH(R₆) ─ C ─ …

│ ║ │

R₄ O O^–

Вторая реакция – восстановление фосфомолибденового, фосфовольфрамового реагента (реактив Фолина) тирозином, триптофаном и некоторыми другими аминокислотами, содержащимися в белках.

Максимальное сине-фиолетовое окрашивание развивается при рН 10, при котором реактив Фолина реакционно способен несколько секунд. Поэтому при добавлении его в пробу необходимо немедленное перемешивание смеси! Окраска должна развиваться не менее 30 мин., после чего окрашенный раствор колориметрируют при длине волны 750 нм (красный светофильтр) против контрольного раствора, включающего воду и все те же реактивы. По величине экстинции и коэффициенту пересчёта, определённому по калибровочной кривой для этого метода, подсчитывают концентрацию белка в растворе, исходя из формулы: .

Чувствительность метода примерно 20-200 мкг белка в 1 см³ пробы. Определению мешают некоторые соединения (сульфат аммония, меркаптоэтанол, мочевина, трис-буфер, аминокислоты, этанол, ацетон и др.). Метод не применим для определения белка в фосфатных буферах, так как в этом случае выпадает осадок.

Исследуемый материал: раствор белка или осаждённый белок.

Реактивы:		Оборудование:
1. Раствор 1н NaOH; 2. реактив А – раствор 2% Na2CO3 в 0,1н NaOH;		1. Пипетки ёмкостью 1, 2 и 5 см3;
3. реактив В – раствор 1% CuSO4; 4. реактив С – раствор 2% калия-натрия виннокислого (сегнетовой соли);		2. микропипетки на 0,1 см3; 3. пробирки химические; 4. ФЭК или СФ;
5. реактив Фолина (приготовление см. приложение);		5. весы аналитические или
6. бычий сывороточный альбумин (кристаллический).		торзионные.

Техника проведения эксперимента. Если мы имеем дело с осаждённым белком, его, прежде всего, необходимо растворить в реактиве А. При плохом растворении добавляют в раствор минимальное количество 1н NaOH до полного растворения белка.

Непосредственно перед определением готовят реактив Д, который получают смешиванием 1 см³ реактива В и 1 см³ реактива С с последующим добавлением к этой смеси 50 см³ реактива А.

Реактив Е готовят из реактива Фолина разведением дистиллированной воды так, чтобы кислотность реактива Е была равна 1н Так, например, если при титровании реактива Фолина оказалось, что его кислотность равна 2,2 н, то для приготовления реактива Е необходимо взять 10 см³ реактива Фолина и 12 см³ дистиллированной воды. Как правило, кислотность реактива Фолина равна 2 н, и его разбавляют в два раза водой для приготовления реактива Е.

К 1 см³ исследуемого раствора, содержащего 20-200 мкг белка, добавляют 5 см³ реактива Д. Смесь энергично перемешивают. Через 10 мин. (в течение которых проходит биуретовая реакция) добавляют 0,5 см³ реактива Е, тщательно перемешивают смесь, Пробирку оставляют на 30 мин. при комнатной температуре для развития окраски.

Интенсивность сине-фиолетового окрашивания измеряют на СФ или ФЭК против контрольного раствора (1 см³ H₂O с 5 см³ реактива Д и 0,5 см³ реактива Е). По полученной экстинции и коэффициенту пересчёта определяют концентрацию белка в пробе, взятой для колориметрирования.

Построение калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой по методу Лоури готовят исходный стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина с концентрацией белка 200 мкг/см³. Для этого навеску белка 20 мг растворяют в 100 см³ дистиллированной воды.

Из исходного стандартного раствора белка готовят серию стандартных рабочих растворов объёмом по 1 см³ в пробирках с содержанием белка 10, 20, 40, 80, 120, 140 и 200 мкг/см³. Приготовление осуществляют согласно данным, приведённым в таблице 2. В контрольную пробу наливают 1 см³ воды. Затем во все пробирки наливают по 5 см³ реактива Д. Через 10 мин. добавляют по 0,5 см³ реактива Е и сразу же интенсивно перемешивают. Через 30 мин. после развития окраски рабочие стандартные растворы колориметрируют против контрольной пробы.

Таблица 2.