1.5. Определение ''сырого протеина''

Определив содержание общего азота в исследуемом материале, можно рассчитать и содержание белка по формуле: при условии, что весь определяемый азот белковый.

Для приблизительной оценки содержания белка в кормовых дрожжах введено понятие ''сырой протеин''. Эта величина определяется как процентное содержание белка в сухой биомассе дрожжей, исходя из известного содержания общего азота. При этом делается допущение, что весь азот является белковым.

(1.5.1.)

Кормовые дрожжи содержат до 40-50 % ''сырого протеина'', однако истинное содержание белка может быть значительно меньшим, поскольку общий азот не является целиком белковым. В определённых условиях культивирования значительную долю общего азота биомассы может составлять азот нуклеиновых кислот, нуклеотидов, свободных аминокислот, олигопептидов, различных аминов, амидов, солей аммония и некоторых других соединений.

Для точного определения содержания белка в биомассе необходимо предварительно выделить его из биомассы. Из белкового экстракта отбирают 1 см³ на определение общего азота по методу Несслера. Рассчитывают процентное содержание белкового азота и белка, экстрагируемого двумя способами, в абсолютно сухих дрожжах.

1.6. Определение белка

Существует несколько способов определения белка:

а) по ультрафиолетовому поглощению;

б) по методу Лоури;

в) биуретовый метод.

Рассмотрим эти методы.

1.6.1. Определение белка по ультрафиолетовому поглощению

Принцип метода. Определение основано на измерении поглощения раствора белка при длине волны 280 нм, при которой имеется максимум поглощения за счёт ароматических аминокислот, входящих в состав белка. Исследуемые растворы белка должны быть относительно свободны от нуклеиновых кислот и нуклеотидов, которые также интенсивно поглощают в этой спектральной области, но имеют максимум поглощения при длине волны 260 нм. Для того, чтобы ввести поправку на поглощение кислот и нуклеотидов, могущих присутствовать в белковых экстрактах, определяют поглощение при 280 нм и при 260 нм. Концентрацию белка в пробах рассчитывают по эмпирической формуле, предложенной Варбургом и Христианом:

(1.6.1.)

Следует отметить, что поскольку содержание ароматических аминокислот в различных белках может довольно сильно отличаться, концентрации могут определяться с заметной ошибкой. Однако, в ряде случаев, когда необходимо проводить сотни определений, этот метод незаменим.

Поскольку рН среды влияет на поглощение, спектрофотометрические измерения проводят в щелочных растворах.

Исследуемый материал: экстракт дрожжевого белка в 1н NaOH или в 15% NaCl с 0.3% Na₂CO₃.

Оборудование:

1. Спектрофотометр;

2. кювета из кварцевого стекла (1 см).

Техника проведения эксперимента. Раствор белка, не содержащий взвешенных частиц (осветление проводят центрифугированием или фильтрованием), спектрофотометрируют против дистиллированной воды в кварцевых кюветах при двух длинах волн – 280 и 260 нм. Полученные значения экстинций используют для расчёта концентрации белка в растворе по формуле (6.1.).

Расчёт процентного содержания белкового азота (Б _{% АСД}) в биомассе абсолютно сухих дрожжей проводится по формуле:

(1.6.2.)

где Б – концентрация белка в пробе, рассчитанная по формуле 1.6.1., мг/см³;

Р – масса навески дрожжей, взятых для экстрагирования белка, г.;

V – объём белкового экстракта, см³;

(100 – W) – сухая масса дрожжей, %;

W – влажность дрожжей, %.