1.3.Определение содержания влаги в образцах. Ускоренный метод с использованием прибора Чижовой.

Этим методом определяют влажность сырья, питательной среды, биошрота, неочищенного ферментного препарата. Сущность метода заключается в высушивании инфракрасными лучами навески исследуемого вещества, помещённой между двумя нагретыми металлическими плитами прибора Чижовой (рис. 1). Прибор имеет два диапазона нагрева: сильный и слабый. Для разогрева прибора пользуются сильным нагревом, для поддержания температуры – слабым.

Рис. 1. Прибор Чижовой для определения влажности:

1. металлические плиты;

2. вилки для регулирования диапазона нагрева;

3. шарнир;

4. термометр.

Для определения влажности предварительно из непроклеенной бумаги заготавливают два пакета, нумеруют их простым карандашом и сушат в течение 3 мин. при 165-170⁰С. Затем их охлаждают в эксикаторе в течение 5-6 мин. и взвешивают на технических весах с точностью до 0,01 г. В заготовленные таким образом пакеты отвешивают из средней пробы образца дрожжей около 1 г. вещества. Навеску равномерно (встряхиванием) распределяют внутри пакета, затем с влажной навеской взвешивают, закладывают в прибор и высушивают при 165-170⁰С в течение 6 мин. После высушивания пакеты с навесками охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

Влажность W (в %) рассчитывают по формуле:

(1.3.1.)

где а – масса сухого пакета с навеской до сушки, г.;

б – масса пустого высушенного пакета, г.;

в – масса пакета вместе с навеской после сушки, г.

Метод высушивания до постоянной массы.

Этот метод является более точным и может быть использован для определения влажности любого объекта.

В предварительно высушенный и доведённый до постоянной массы бюкс отвешивают 1-2 г. исследуемого вещества с точностью до 0,0001 г. Бюкс помещают на два часа в сушильный шкаф с температурой 60-80⁰С, затем температуру повышают до 105⁰С. В процессе высушивания бюкс периодически взвешивают: первый раз через 4 часа, затем каждый час. Перед взвешиванием бюкс охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. Образец считается высушенным до постоянной массы, когда разность между двумя последними взвешиваниями не превышает 0,001 г. Влажность W (в %) рассчитывают по формуле:

, (1.3.2.)

где а – масса навески перед сушкой, г.;

в – масса навески после сушки, г.

1.4. Определение общего азота

Содержание азота в большинстве белковых образцов практически постоянное и, в среднем, составляет около 16% от массы белка. Зная количество азота в пробе белка, можно практически точно определить содержание белка в пробе (при условии, что весь азот белковый) по формуле:

, (1.4.1.)

где N – содержание азота в пробе;

Б – содержание белка в пробе;

6,25 – коэффициент пересчёта (100/16).

Принцип метода определения общего азота по Несслеру.

Во всех используемых методах определения общего азота навеску анализируемого материала предварительно сжигают в присутствии серной кислоты, образуя сульфат аммония:

2 NH₃ + H₂SO₄ = (NH₄)₂SO₄

Для ускорения окисления добавляют катализаторы или пероксид водорода.

Концентрация катионов аммония может быть легко определена титрованием по методу Кьельдаля (после вытеснения аммиака крепкой щёлочью) или колориметрическим методом с реактивом Несслера (K₂HgI₄). Второй метод занимает мало времени и не требует специальной установки для отгонки аммиака.

В состав реакции Несслера (рН 12,0) входит щёлочь KOH и при добавлении его к раствору (NH₄)₂SO₄ происходят следующие реакции:

(NH₄)₂SO₄ + 2 KOH = K₂SO₄ + 2 NH₃ + 2 H₂O (1.4.3.)

В результате образуется соединение жёлтого цвета. Интенсивность окрашивания раствора прямо пропорциональна концентрации катионов аммония. Определив оптическую плотность раствора на СФ или ФЭК, по калибровочной кривой можно определить концентрацию катионов аммония (и, следовательно, азота) в исследуемом растворе.

Исследуемый материал: дрожжи Saccharomyces cerevisiae прессованные (влажность около 75%) или любая микробная биомасса.

Реактивы:			Оборудование:
1. Серная кислота концентрированная (d = 1,84);			1.Весы аналитические или торзионные;
2. пероксид водорода (30%);			2. пробирки химические;
3. едкий натрий (или калий), 0,5н. раствор;			3. воронки химические; 4. пипетки на 1, 2 и 5 см3;
4.спиртовой раствор фенолфталеина (приготовление: см. приложение);			5. микробюретка; 6. мерные колбы на 50 см3;
5. реактив Несслера (приготовление: см. приложение); 6. стандартный раствор сернокислого или хлористого аммония (приготовление: см. приложение).		7. ФЭК; 8. печь для сжигания материала в пробирках.

Техника проведения эксперимента. Навеску прессованных пекарских дрожжей 90-110 мг. (или кормовых дрожжей 30-40 мг.) помещают в пробирку, приливают 2 см³ концентрированной серной кислоты и 5-6 капель пероксида водорода. Пробирку закрывают стеклянным затвором (можно использовать маленькие воронки с запаянным дном) и помещают в печь для сжигания под тягой. Продолжительность сжигания 5-10 мин. Окончание окисления узнаётся по полному обесцвечиванию жидкости в пробирке. Если окраска чёрного или жёлтого цвета, следует охладить пробирку, добавить 2-3 капли H₂O₂ и вновь сжигать до полного обесцвечивания. Следует избегать бурного кипения при нагревании!

По окончании окисления пробирку охлаждают и её содержимое количественно переносят в мерную колбу на 50 см³. Затвор ополаскивают дистиллированной водой и смыв также переносят в колбу, после чего доливают водой до метки. Из колбы отбирают 1 см³ и оттитровывают 0,5н NaOH (или KOH) из микробюретки по фенолфталеину (1-2 капли) до слабо-розовой окраски для определения содержания H₂SO₄.

После этого из первой колбы отбирают 10 см³ и помещают в другую мерную колбу на 50 см³. Добавляют для нейтрализации рассчитанное количество 0,5 н NaOH (или KOH) и доводят дистиллированной водой до метки.

Очень важно точно оттитровать и определить количество щёлочи, необходимое для нейтрализации 10 см³ опытного раствора, так как перещелачивание является причиной помутнения раствора, а недощелачивание вызывает выпадение солей ртути и опыт считается испорченным.

Из второй колбы берут в пробирки для колориметрирования три пробы по 5 см³ реактива Несслера и сразу колориметрируют при длине волны 420 нм. (синий светофильтр) против контрольного раствора (5 см³ воды с 0,5 см³ реактива Несслера). По показанию ФЭК и калибровочной кривой определяют концентрацию азота в пробирке в мкг/см³.

Построение калибровочной кривой. Принцип построения калибровочных кривых одинаков для всех колориметрических методов. Оптическая плотность, или экстинция (Е) окрашенного вещества в растворе прямо пропорциональна его концентрации (в определённом интервале) и это используют для его количественного определения. Колориметрирование осуществляют при длине волны, соответствующей максимуму поглощения данного окрашенного раствора.

Для построения калибровочной кривой для метода Несслера готовят три одинаковых серии раствора согласно таблице 1. Из основного стандартного раствора соли аммония, содержащего 20 мкг азота в 1 см³, готовят рабочие стандартные растворы объёмом по 5 см³ с известной концентрацией азота. В контрольную пробу наливают 5 см³ воды. Затем во все пробирки добавляют по 0,5 см³ реактива Несслера, содержимое пробирок хорошо перемешивают и сразу же растворы колориметрируют против контрольной пробы.

Таблица 1.