3.1. Фракционирование белков методом колоночной гель-хроматографии.

Принцип метода. Хроматография – это физико-химический метод разделения смеси веществ на границе раздела двух несмешивающихся фаз, одна из которых подвижна, а другая нет. При гель-хроматографии (гель-фильтрации) происходит разделение смеси веществ по величине их молекул. В качестве твёрдой фазы используют простые набухшие пористые частицы декстранового или полиакриламидного геля, которыми заполнена колонка. При разделении смеси веществ молекулы, имеющие размер меньший, чем поры гелевых частиц, диффундируют в них и поэтому выходят из колонки позже, чем молекулы, которые из-за большого размера не могут проникнуть в фазу геля. Т.е. при гель-фильтрации происходит разделение веществ по размеру молекул (в зависимости от коэффициента диффузии) по принципу молекулярного ''анти-сита'' – большие молекулы просеиваются быстрее, а малые молекулы задерживаются. В таблице 3, в качестве примера, приведены некоторые гель-фильтрационные характеристики различных типов сафадекса. Интервалы, приведённые в таблице, указывают на то, что вещества с молекулярной массой, большей или меньшей, не будут разделяться при гель-фильтрации, а будут выходить одной зоной.

Таблица 3.

Гель-фильтрационные характеристики различных типов сефадекса.

Тип геля	Полный объём геля после набухания в воде, см3/г сухого геля	Интервал молекулярных масс разделяемых веществ
1	2	3
Г – 10	2 – 3	до 700
Г – 15	2,5 – 3,5	до 1500
1	2	3
Г – 25	4 – 6	1000 – 5000
Г – 50	9 - 11	1000 – 30000
Г – 75	12 – 15	3000 – 70000
Г – 100	15 – 20	4000 – 150000
Г – 150	20 – 30	5000 - 400000
Г – 200	30 – 40	5000 - 800000

Преимущество гель-хроматографии перед другими хроматографическими методами заключается в возможности многократно использовать колонки. В большинстве случаев этот метод используют как препаративный для выделения и очистки каких-либо соединений, реже как аналитический для определения молекулярной массы.

Колонку с гелем перед работой калибруют. Для этого определяют свободный объём колонки (V₀), равный разнице объёма заполнения колонки набухшим гелем и объёма гелевой фазы. Для определения применяют голубой декстран – ''2000'' – высокомолекулярный полисахарид с голубым красителем с молекулярной массой 2 млн. Да заведомо известно, что это соединение не проникает в гелевые частицы и выходит из колонки в объёме, равном свободному объёму (рис. 3). Как видно из профиля элюции на рис. 3, концентрация разделяемых веществ в элюате, выходящем из колонки, имеет гауссово распределение за счёт имеющей здесь место диффузии вещества в растворителе. Раствор голубого декстрана, нанесённый, к примеру, в объёме 2 см³, выйдет из колонки в несколько большем объёме (5-10 см³).

Рис. 3. Профиль элюции при гель-хроматографии (на колонку нанесена смесь белков; отмечены свободный объём колонки, объёмы элюции для первого и второго белка; Е – экстинция).

Поэтому для точного определения V₀ фракции элюата колориметрируют при длине волны 630 нм (максимум поглощения голубого декстрана) и определяют фракцию, где интенсивность окраски наибольшая и, соответственно, максимальная концентрация голубого декстрана. Объём элюата, вышедшего из колонки до этой фракции включительно, даёт значение искомой величины V₀.

Точно также определяют значение объёмов элюции (V_Е) для разделяемых веществ (рис. 3). Определение концентраций белка во фракциях можно провести по любому из описанных в предыдущих разделах методу. По значениям V₀ и V_E можно рассчитать молекулярную массу разделяемых веществ. Например, молекулярная масса (М) соединений, подвергающихся гель-фильтрации на сефадексе Г – 75, определяют по следующей формуле:

(3.1.)

Для сефадексов Г – 100 и Г – 200 предложены следующие формулы, соответственно (3.2.) и (3.3.) и т.д.:

(3.2.)

(3.3.)

При гель-фильтрации смесь разделяемых веществ в минимальном объёме (2-3% от объёма колонки) наносят на поверхность геля в колонке и подают растворитель (элюент). Чем меньше наносимый объём и чем больше соотношение высоты и диаметра колонки, тем лучшее разделение (разрешение) будет достигнуто.

В качестве элюента используют различные буферные растворы или просто воду (с небольшим добавлением какой-либо нейтральной соли для снятия ионообменного эффекта). Смесь разделяемых веществ должна быть свободна от загрязняющих механических примесей, а также липидов и липопротеидов, которые могут необратимо сорбироваться на декстрановые гели.

При элюировании растворитель должен протекать через колонку со скоростью 2-5 см³/час/см² для сильно сшитых гелей и около 10 см³/час/см² для крупнопористых гелей. Обычно при уменьшении скорости протекания элюента через колонку разрешение улучшается.

Исследуемый материал: раствор дрожжевых альбуминов.

Реактивы:		Оборудование:
1. Сефадекс Г – 100;		1. Колонки стеклянные (1-2см 30-40 см);
2. Сефадекс Г – 25 (сухой);		2. Колбы круглодонные на 0,5 дм3;
3. NaCl, 0,1% раствор;		3. Воронки химические;
4. Голубой декстран – ''2000'';		4. Пробирки химические;
5.Двухромовый калий (K2Cr2O7), насыщенный;		5. Пипетки на 1, 2 и 5 см3; 6. Микропипетки на 0,1 см3;
6. Сахароза (кристаллическая);		7. Шприц медицинский на 2-5 см3;
7. Все реактивы для метода Лоури или микрометода определения белка с помощью биуретового реактива.		8. Стекловата и паралон; 9. Фильтры бумажные (плотные); 10. Трубки силиконовые (диаметром 0,2-0,4 мм); 11. Коллектор автоматический для отбора фракций; 12. ФЭК или СФ.

Техника проведения эксперимента. Гелю дают набухнуть в воде и заполняют им колонку (см. приложение). Над гелем всегда должен оставаться слой воды (0,1% NaCl) 2-5 см. Кран на выходе из колонки должен быть закрыт.

Приготовление образца для нанесения на колонку. К 20 см³ раствора дрожжевых альбуминов добавляют около 3,5 г сухого сефадекса Г – 25 для концентрирования и выдерживают 1 час на водяной бане при 60⁰С для лучшего набухания геля. В соответствии с данными таблицы 3, гель вберёт в себя около 15 см³ воды. Набухший гель отделяют от сконцентрированного раствора альбуминов фильтрованием через бумажный фильтр. Небольшую часть раствора оставляют на холоду для определения молекулярной массы методом гель-фильтрации в тонком слое.

Параллельно растворяют 20-4- мг голубого декстрана в 1 см³ воды в пробирке (при нагревании и постоянном перемешивании). В одной пробирке смешивают 2-3 см³ сконцентрированного раствора дрожжевых альбуминов, 1 см³ раствора голубого декстрана и 0,25 см³ концентрированного раствора K₂Cr₂O₇. К полученной смеси добавляют 200-300 мг сахарозы для увеличения плотности и наносят на колонку.

Нанесение образца на колонку. Наносить исследуемый раствор на поверхность геля удобно с помощью медицинского шприца, на который одета длинная гибкая трубка. Конец трубки подводят под слой воды (0,1% NaCl) к самой поверхности геля. Образец аккуратно наслаивают на гель так, чтобы не нарушить целостность его верхнего слоя. Ровная граница между гелем и наслоённым раствором – одно из необходимых условий хорошего разделения веществ. Образец не перемешивается с элюатом, находящимся сверху, благодаря повышенной плотности.

Элюция. Для элюирования колонку герметично соединяют трубкой с резервуаром, в котором налито 200-300 мл 0,1% раствора NaCl, и открывают кран на выходе колонки (рис. 4). Элюент должен попадать в колонку сразу под поверхность водного слоя, а не капать сверху. Изменением высоты резервуара (рис. 4) устанавливают оптимальную скорость протекания. С помощью автоматического коллектора отбирают в пробирки фракции элюата (объёмом 2-3 мл), выходящего из колонки.

Во фракциях определяют содержание разделяемых веществ и строят профиль элюции, как показано на рис. 3. Фракции, содержащие голубой декстран и K₂Cr₂O₇ колориметрируют при длине волны 630 и 450 нм соответственно. Из пробирок с белком отбирают пробы по 0,1 мл, доводят их водой до 1 мл и определяют в них содержание белка по методу Лоури.

В

Рис. 4. Нанесение смеси разделяемых веществ на колонку при гель-хроматографии:

1. колонка; 2. гель; 3. элюент; 4. резервуар; 5. стекловата или паралон; 6. кран; 7. пробирки в коллекторе; 8. шприц; 9. смесь разделяемых веществ.

соответствии с таблицей 3 для сефадекса Г – 100 первым пиком должны выйти из колонки все соединения с молекулярным весом более 150000 (включая голубой декстран), а последним пиком – все соединения с молекулярным весом менее 4000 (включая K₂Cr₂O₇). Поэтому целесообразно проводить обнаружение разделившихся белков только между этими пиками. Голубой декстран и K₂Cr₂O₇ добавляют только при калибровке колонки и по разности их объёмов элюции определяют, в каком интервале отбираемых фракций следует искать разделяемые вещества.

Свободный объём колонки (V₀) определяют умножением числа фракций, вышедших до появления максимальной концентрации голубого декстрана, на объём отбираемых фракций. Так же определяют объёмы элюции (V_E) для отдельных фракций дрожжевых альбуминов. В соответствии с (3.2.) определяют их молекулярную массу.

Лабораторная работа 4.

''Определение молекулярной массы отдельных фракций дрожжевых альбуминов и глобулинов методом гель-хроматографии в тонком слое''.

Все этапы этого занятия, а также необходимые реактивы и оборудование описаны в разделе 3.

Более точные значения молекулярных масс белков получают методом гель-хроматографии в тонком слое сефадекса (или акрилекса). Принцип разделения веществ остаётся тот же самый, меняется только техника эксперимента.

На стеклянную пластинку наносят тонкий слой набухшего геля (0,3-0,5 мм). От равномерности и качества слоя зависит точность получаемых результатов. В нескольких точках на стартовой линии наносят стандартные растворы белков с известными молекулярными массами и исследуемый белковый препарат. Пластинку помещают в хроматографическую камеру под углом 15-20⁰, соединяют гелевую фазу бумажными фитилями с растворителем в кюветах, закрывают камеру крышкой и хроматографируют. В качестве растворителя также используют различные буферные растворы или просто воду (с добавлением нейтральных солей для снятия ионообменного эффекта).

По окончании хроматографии на пластинку с гелем накладывают лист плотной хроматографической бумаги того же формата. При этом белки переходят из геля на бумагу. Белковые пятна на бумаге окрашивают в синий цвет бромфеноловым синим. Измеряют расстояние (L) от стартовой линии до центра белковых пятен. Исходя из полученных результатов и известных величин молекулярных масс, строят калибровочную кривую (рис.5). Для этого используют полулогарифмическую шкалу. По оси абсцисс откладывают 100/на длину пробега белка L (см), а по оси ординат (логарифмической шкале) – значение его молекулярной массы. По этой калибровочной кривой и находят значение молекулярной массы исследуемого белка. В каждом эксперименте необходимо строить отдельную калибровочную кривую.

Исследуемый материал: растворы дрожжевых альбуминов и глобулинов.

Реактивы:		Оборудование:
1. Сефадекс Г – 100;		1.Хроматографическая камера с крышкой (мо-
2. NaCl, 0,1% раствор;		жно использовать камеру для электрофореза
3. Голубой декстран – ''2000'';		на бумаге);
4. Сахароза (кристаллическая);		2. Кюветы для растворителя;
5. Бромфеноловый синий, 0,1% раствор в 7% уксусной кислоте;		3. Стеклянная пластинка 20 30 см; 4. Хроматографическая бумага плотная (луч- ше всего Ватман 3ММ); 5. Микрошприц на 10 мкл (или стеклянный
6. Уксусная кислота, 7% раствор;
7. Белок куриного яйца;		капилляр);
8. Бычий сывороточный альбумин (кристаллический);		6. ножницы; 7. линейка с делениями;
9. Цитохром ''С''.		8. Карандаш простой; 9. Кювета для окраски хроматограммы; 10. Миллиметровая бумага с полулогариф- мической шкалой.

Техника проведения эксперимента. Сефадекс Г – 100 для тонкослойной хроматографии готовят так же, как и в предыдущем случае (см. приложение).

Приготовление тонкого слоя геля: на чисто вымытую обезжиренную стеклянную пластинку (20 30 см), расположенную горизонтально, помещают около 30 см³ густой суспензии набухшего геля и распределяют тонким слоем (0,3-0,4 мм) по поверхности пластинки. Для этого гель раскатывают своеобразной ''скалкой'': на длинную стеклянную палочку (около 400 см) надевают с двух сторон два маленьких обрезка резиновой трубки (толщина резины примерно 0,4-0,5 мм, что определяет толщину гелевого слоя). Расстояние между резиновыми кольцами делают немного меньшими ширины пластинки. Такую ''скалку'' устанавливают резиновыми кольцами на края пластинки и раскатывают гель в продольном направлении, держась за выступающие концы стеклянной палочки.

На обратной стороне пластинки до раскатки геля отмечают стартовую линию (примерно 2 см от обреза) и места нанесения образцов, отстоящие друг от друга и то кромки гелевого слоя не менее чем на 2-3 см. После нанесения геля размеченную пластинку помещают в хроматографическую камеру под углом 15⁰. Край пластинки со стартовой линией должен быть выше. Затем на края пластинки накладывают фитили, вырезанные из хроматографической бумаги и намоченные в растворителе (0,1% раствор NaCl). Камеру закрывают крышкой и дают возможность протекать растворителю в течение 1 часа.

Приготовление образцов и их нанесение. Количество наносимого белка существенно не влияет на результаты определения молекулярной массы. Белка должно быть достаточно, чтобы выявит при окраске бромфеноловым синим. Напротив, объём, в котором наносится белок, влияет на размер белкового пятна и, соответственно, на результаты определения. Поэтому наносить образец желательно в минимальном объёме (ориентировочно 10-15 мкг индивидуального белка в 1-5 мкл).

Готовят стандартные растворы белков с известными молекулярными массами (маркеры) в соответствии с данными, приведёнными в таблице 4.

В исследуемые растворы дрожжевых глобулинов и альбуминов, полученных ранее, также добавляют сахарозу до конечной концентрации около 5%. Наносить следует около 200 мкг белка в 5 мкл. Если концентрация белка в этих растворах гораздо ниже, то их предварительно концентрируют с применением сухого сефадекса

Г-25, как описано в предыдущем разделе.

Рис. 5. Гипотетическая калибровочная кривая для определения молекулярной массы белка методом гель-хорматографии в тонком слое (М – молекулярная масса белка; L – длина пробега белкового пятна в см).

Таблица 4

Приготовление маркеров для гель-хроматографии в тонком слое и значения их молекулярного веса

Маркеры	Молекулярный вес	Длина пробега, мм	Приготовление для нанесения на пластинку
1	2	3	4
1.Цитохром ''С''	13000		25 мг растворить в 0,5 мл 0,1 % NаС1, добавить 50 мг сахарозы, наносить 2-3 мкл.
2. Белки куриного яйца: а) лизоцим б) овальбумин г) овидин	13900 45000 49000		25 мг + 1 мл Н2О, добавить 2 мл 0,1 % NаС1, тщательно перемешать до полного растворения, добавить 200 мл сахарозы, наносить 5 мкл.
1	2	3	4
3. Бычий сывороточный альбумин	68000		50 мг растворить в 0,5 мл 0,1 % NаС1, добавить 50 мг сахарозы, наносить 1-2 мкл.
4. Голубой декстран-''2000''	2 млн.		10-20 мг растворить в 0,5 мл Н2) при нагревании, добавить 50 мг сахарозы, наносить 5-10 мкл.

Для нанесения исследуемых образцов и маркеров на гель, пластинку устанавливают горизонтально и после нанесения возвращают в исходное положение. Камеру закрывают крышкой и хроматографируют до тех пор, пока пятно голубого декстрана не подойдет к нижнему краю пластинки. После этого пластинку вынимают и кладут на горизонтальную поверхность.

Для снятия ''отпечатка'' белковых пятен вырезают из хроматографической плотной бумаги лист по размеру пластинки и прикладывают его плотно к слою геля на 1-2 мин. Затем лист помещают в кювету с 0,1% раствором бромфенолового синего в 7% СН₃СООН на 5 мин. Избыток красителя и жёлтый фон отмывают в кювете с тёплым раствором 7 % СН₃СООН (несколько смен). После этого отпечаток хроматограммы высушивают и измеряют расстояния, пройденные маркерами и исследуемыми белками. Полученные данные вносят в таблицу 4 и на их основе строят калибровочную кривую на полулогарифмической шкале, как показано на рис. 5. По ней определяют молекулярный вес исследуемых белков.

Приложение.

Приготовление реактивов и некоторые методические приёмы.

1. Реактив Несслера. В 100 см³ дистиллированной воды растворяют 34,9 г KI, затем в этот же раствор добавляют 45,5 г HgI₂. Отдельно в 150 см³ дистиллированной воды растворяют 112 г KOH и охлаждают до комнатной температуры. После этого оба раствора сливают вместе и, доведя до объёма 1 дм³ водой, оставляют на несколько дней на холоду для осаждения избытка ртутных солей. Выпавший осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре №3, а полученный бесцветный или слегка желтоватый раствор хранят в тёмной склянке на холоду.