2.2. Фракционирование белков с помощью диализа.
Диализом называется процесс разделения низко- и высокомолекулярных веществ с использованием полупроницаемых перегородок (мембран). Молекулы низкомолекулярных веществ, диаметр которых значительно меньше диаметра пор, свободно проходят через мембрану в раствор. Для высокомолекулярных веществ мембрана непроницаема.
В связи с этим диализ широко используют при очистке различных белков, при удалении низкомолекулярных загрязняющих веществ, компонентов растворителей и солей.
Для диализа используют тонкие целлофановые мембраны, которые при замачивании набухают и образуют своеобразное молекулярное сито со средним диаметром около 2 нм. При диализе белковых растворов белки и другие высокомолекулярные соединения не могут пройти через такие поры, а низкомолекулярные соединения проходят через них свободно.
При диализе против воды через некоторое время получается раствор белков в воде, представляющий собой смесь альбуминов и глобулинов: глобулины должны выпасть в осадок, т.к. они не растворяются в воде.
Исследуемый материал: раствор суммарных дрожжевых белков.
Реактивы:
1. Раствор 5% Na2CO3
2. Все реактивы для метода Лоури или микрометода определения белка с помощью биуретовой реакции.
Оборудование:
|
||
1. Кристаллизатор ёмкостью 5 л; |
|
6. Воронки химические; |
2. Целлофан листовой (или в виде трубки); |
|
7. Пипетки на 1 и 5 мл; 8. Мерные цилиндры на 25 мл; |
3. Стеклянные трубки (диаметр 10 мм, длина 70-100 мм); |
|
9. Центрифужные стаканы; 10. Центрифуга; |
4. Суровые нитки; |
|
11. Всё оборудование для метода Лоу- |
5. Ножницы; |
|
ри или микрометода определения белка с помощью биуретовой реакции. |
Техника проведения эксперимента. Из целлофана вырезают круг диаметром около 15 см и кипятят в 5% Na2CO3 вместе с суровыми нитками 10-15 мин., после чего хорошо промывают дистиллированной водой. Целлофановый круг собирают в мешочек, завязывают его вокруг стеклянной трубки суровыми нитками и проверяют на отсутствие течи (налив в мешочек воды через стеклянную трубку).
20 см3 раствора белка, полученного при перерастворении ацетонового осадка (раздел 2.1.2.), помещают в диализный мешочек. Мешочек помещают в кристаллизатор с дистиллированной водой так, чтобы содержимое мешочка было не выше уровня воды. Диализ проводят при комнатной температуре с двумя сменами воды в течение двух дней.
По окончании диализа содержимое диализного мешочка переносят в центрифужный стакан и отделяют осадок выпавших глобулинов от супернатанта, содержащего растворённые альбумины, центрифугированием при 6 тыс. об/мин. в течение 10 мин. Надосадочную жидкость (раствор альбуминов) сливают в мерный цилиндр и измеряют объём (при диализе объём может изменяться).
Осадок глобулинов растворяют в 5 см3 реактива А. Определяют концентрации белка в полученных растворах по методу Лоури или микрометоду с помощью биуретового реактива. Рассчитывают выход суммарного белка из экстракта дрожжевых белков после осаждения ацетоном и последующего диализа по формуле (2.2.1.). Растворы белков хранят на холоду и используют для дальнейших исследований.
(2.2.1.)
где с1 – концентрация альбуминов в диализате, мг/см3;
V1 – объём диализата после центрифугирования, см3;
с2 – концентрация глобулинов, растворённых в реактиве А, мг/см3;
V2 – объём раствора глобулинов, см3;
с0 – концентрация белка в исходном экстракте, мг/см3;
V0 – объём исходного водного экстракта белка, взятого на осаждение ацетоном, см3.
Соотношение альбуминов и глобулинов определяется как процентная доля каждого белка, если из сумму принять за 100%:
(2.2.2.)
(2.2.3.)
Лабораторная работа 3.
''Фракционирование дрожжевых белков методом гель-фильтрации''.
План работы.
1. После диализа разделить глобулины и альбумины, определить их содержание по методу Лоури или микрометоду с помощью биуретового реактива и рассчитать их выход. Раствор глобулинов сохранить до 4 занятия (раздел 3.1.).
2. Подготовить колонку для гель-фильтрации и прокалибровать её (раздел 3.1.).
3. Сконцентрировать раствор альбуминов. Часть раствора сохранить до 4 занятия. Провести гель-фильтрацию. Построить профиль элюции. Рассчитать примерные молекулярные массы отдельных фракций дрожжевых альбуминов (раздел 2.2.).