Методична розробка з медичної мікробіології, вірусології та імунології

Автор Н.Г.Смотрова Затверджено на засіданні кафедри

"___" _______________ 200__р.,

протокол №_______

Тема: Вібріони. Мікробіологічна діагностика холери. Хелікобактерії. Мікробіологічна діагностика хелікобактериіозів.

Актуальність теми. Холера –це особливо небезпечна кишкова інфекція. В зрівнянні з початком віку захворювання на холеру значно знизилась, але зараз людство переживає 7 пандемію цього захворювання, викликану новим біотопом збудника –Vibrio cholerae eltor. За останні 30 років холера неодноразово проникала в південні райони країн СНД. Боротьба з холерою вимагає бистрої та надійної діагностики, проведення глибокого бактеріологічного аналізу, проведення широких протиепідемічних заходів. В період спалахів холери до боротьби з нею приєднаються лікарі самих різних спеціальностей Вивчення цієї теми дозволяє лікарю скласти уяву про морфологічні, антигенні, патогенні властивості збудників захворювань на холеру та хелікобактеріоз. Висновки про те, що більшість виразкових явищ мають зв’язок з H. Pylori, призвело к перегляду погляду на природу виразкового патогенезу. Вивчення властивостей хелікобактерій мають важливе значення для впровадження нових методів лікування виразкового захворювання. Знання цих питань дозволить лікареві зробити вірний вибір діагностики хворих та напрямку лікування.

Мета (загальна): уміти оцінювати та аналізувати результати прискореної та розгорнутої ідентифікації збудників холери та хелікобактеріозів.

Конкретні цілі – уміти:

1. Описувати особливості зросту збудників холери на різних середовищах.

2. Готувати мазки із плівки, та пофарбувати за методом Грама, оцінити рухливість вібріонів та кампілобактерій на препараті “висяча крапля”.

3. Ставити реакцію аглютинації на склі з О-холерною та типовими сироватками та оцінювати результати.

4. Оцінювати сахаролітичні властивості вібріонів на середовищах Хейберга.

5. Аналізувати результати фаготипування, гемагглютинаціі курячих еритроцитів, еритроцитів барана, поліміксинової проби та реакції Фогеса-Проскауера

6. Оцінювати уреазну, каталазну та оксидазну активність H.pylori

Базовий рівень знань – умінь:

1. Характеризувати морфологію та систематику вібріонів та кампілобактерій.

2. Класифікувати антигени збудників кишкових інфекцій.

3. Оцінювати патогенні властивості бактерій.

4. Вибирати живильні середовища для селекції та ідентифікації збудників кишкових інфекцій.

Для того, щоб ви могли уяснити, чи відповідає базовий рівень Ваших знань-умінь необхідному, пропонуємо виконати ряд завдань

Завдання 1. Назвіть морфологічні властивості, та систематичну приналежність вібріонів

Завдання 2. Назвіть антигени ентеробактерій

Завдання 3. Назвіть фактори патогенності бактерій-збудників кишкових інфекцій.

Завдання 4. Назвіть основні селективні та діференціально-діагностичні живільні середовища для бактерій кишкової групи.

Інформацію для поповнення знань-умінь можна знайти у наступних підручниках:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под ред. Л.Б.Борисова, А.М.Смирновой. М.: Медицина,1994.С. 27-39, 186-188, 267-269

2. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. /Под ред. Л.Б.Борисова. М.: Медицина, 1984.С23-24

Теоретичні питання, на основі яких можливе виконання цільових видів діяльності:

1. Класифікація та морфологія вібріонів

2. Культуральні та біохімічні властивості збудників холери.

3. Антигени холерних вібріонів: їх значення для діагностики

4. Патогенні властивості збудників холери.

5. Профілактика холери.

6. Методи та етапи мікробіологічної діагностики холери.

7. Біологічні властивості Helikobacter pylori

8. Патогенез хелікобактерної інфекції.

9. Сучасні методи діагностики та лікування хелікобактерної інфекції

Література для засвоєння знань-умінь за даною темою:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Под. ред. Л. Б. Борисова, А. М. Смирновой. – М.: Медицина, 1994. С.322-326

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология - СПБ: Специальная литература, 1998.С. 394 –406.

3. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. /Под ред. Л.Б.Борисова. М.: Медицина, 1984.С 188-193.

Зміст навчання повинен забезпечити досягнення цілей навчання, чому сприяє граф логічної структури теми: „Збудники холери та хелікобактерної інфекції ” (додаток 1).

Орієнтовна основа дії при виконанні практичної роботи.

1. З метою прискореної діагностики холери розглянути посіви патологічного матеріалу (фекалії, блювотні маси, вода та ін.) на лужну пептонну воду. Описати в протоколі особливості росту збудника на рідкому поживному середовищі.

Приготувати мазок з плівки, що утворилася на поверхні поживного середовища та пофарбувати його за Грамом. Препарат промікроскопувати, малюнок занести до протоколу. 2.Приготувати також препарат «висяча крапля» або «розчавлена крапля», користуючись методом темнопольної мікроскопії оцінити рухливість бактерій.

3.Поставити реакцію аглютинації на склі суспензії бактерій, що досліджуються з О-холерною сироваткою. Врахувати результат реакції.

4.Поставити нітрозо-індолову пробу (реакція холера - рот). Холерні вібріони утворюють індол, відновлюють значну кількість нітратів (КNO₃) середовища в нітрити (КNО₂). При додаванні до 24-годинної культури у пептонній воді концентрованої H₂SО₄ з розрахунку 2-3 краплі на 1 мл культури звільнюється НNО₂, яка зв‘язується з індолом та утворює нітрозо-індол (рубіново-червоне забарвлення середовища). Дати попередню відповідь про видову приналежність виділеного збудника.

5. Для розгорнутого бактеріологічного дослідження при підозрі на холеру розглянути посіви патологічного матеріалу на лужний агар для отримання ізольованих колоній. Описати вигляд типової колонії, відсіяти її на скошений агар для накопичування чистої культури. Визначення роду збудника співпадає з п. 2.

6. Відмінність виділеного збудника від холероподібних вібріонів встановити за допомогою наступних тестів:

а) розгорнута реакція аглютинації культур, що досліджуються з О- холерною сироваткою (врахування готової реакції). Відмітити, з якою культурою реакція позитивна до титру аглютинуючої сироватки;

б) визначення діастатичної активності при посіві культури на 1%-ву пептонну воду з 0,5%-ми розчинного крохмалю (середовище Кодама) . Після інкубації при 37^оС протягом 6 годин у пробірку додають декілька крапель розчину Люголя. При розкладанні крохмалю синє забарвлення середовища не спостерігається;

в) сахаролітичні властивості - досліджуються при посіві на середовища Хейберга, що містять в якості джерела вуглецю сахарозу, мальтозу чи арабінозу. Ферментація того або іншого цукру призводить до зміни рН середовища, що реєструється за зміною забарвлення індикатора.

7.Поставити реакцію аглютинації на склі з типовими сироватками Огава та Інаба (для культури, що дала позитивну реакцію з О-холерною сироваткою). Визначити серотип виділеного збудника.

8. Провести ідентифікацію біотипу виділеного збудника за допомогою наступних тестів:

а) реакція гемаглютинації курячих еритроцитів. На предметне скло наносять краплю фізіологічного розчину і розтирають в ній петлю 18-годинної агарової культури, додають краплю 2,5%-вої суспензії курячих еритроцитів. В якості контролю використовуються: 1) крапля фізіологічного розчину + крапля 2,5%-вої суспензії еритроцитів, 2) крапля фізіологічного розчину + крапля культури, що досліджується. При позитивній реакції через 1 хвилину настає склеювання еритроцитів. Контролі повинні давати негативний результат. Холерні вібріони Ель-тор аглютинують курячі еритроцити, класичні холерні вібріони - ні;

б) гемолітична активність. У бульйонній культурі вібріону з еритроцитами барана гемоліз настає через 2 години інкубації при 37^оС. Раніше спроможність вібріонів Ель-тор лізірувати у рідкому середовищі еритроцити барана вважалася їх основною відмінністю від класичних вібріонів. Зараз ця реакція втратила своє значення для диференціації класичних вібріонів і вібріонів Ель-тор, вона також не є специфічною саме для холерних вібріонів, частіше вона властива для NAG вібріонів. Однак цю властивість необхідно визначати для повної характеристики виділеного штаму;

в) поліміксинова проба. В розплавлений та охолоджений агар додають поліміксин з розрахунку 50 ОД на 1мл, середовище перемішують і розливають у чашки Петрі. На сектори засівають петлею або пастеровською піпеткою культури, що досліджуються. Вібріони Ель-тор ростуть на середовищі з поліміксином, класичні холерні вібріони - ні;

г) реакція Фогеса-Проскауера. Культуру вібріону засівають у пробірку з 5 мл глюкозо-фосфатного бульйону. Через 1-3 доби до 1мл культури, що виросла, додають 0,6 мл a-нафтолу та 0,2 мл 40%-вого розчину КОН. Пробірки ставлять у термостат на 30 - 60 хвилин. При позитивній реакції з'являється червоне забарвлення середовища внаслідок утворення ацетилметилкарбінолу з глюкози. Холерні вібріони Ель-тор частіше дадуть позитивну реакцію Фогеса-Проскауера, але можуть і не давати. Класичні холерні вібріони не утворюють ацетилметилкарбінолу, тому реакція негативна;

д) лізіс фагами. Досліджувану культуру було засіяно газоном на чашці Петрі і нанесено по краплі холерного фага С та фага Ель-тор 2. Відзначити відсутність росту культури в місці внесення того або іншого фагу.

9.Результати тестів занести у таблицю, порівняти властивості виділеної культури та відомих біоварів холерного вібріону. Зробити кінцевий висновок з ідентифікації збудника.

10. Ознайомитися з методами мікробіологічної діагностики хелікобактеріозів:

а) Розглянути гістологічні препарати, пофарбовані гематоксілін-еозином або імпрегновані сріблом за Уортином-Старі. Знайти у препаратах зігнуті, S- подібні, або у вигляді “крил чайки” бактерії, малюнок занести у протокол.

б) розглянути посіви чистої культури H.pylori на агарі із додаванням 5-17% еритроцитів та антибіотика цефалоспорину або на “шоколадному” агарі, які культивувалися у мікроаерофільних умовах (концентрація СО₂ 5-10%). Описати культуральні ознаки збудника у протоколі.

в) ознайомитися із методом індикації H.pylori у біоптатах через визначення уреазної активності (кло-тест) та імуноферментними тест-системами для діагностики хелікобактеріозів.

Після ознайомлення з теоретичними питаннями і ходом проведення експерименту вам пропонується виконати наступні навчаючи завдання.

1.До інфекційного відділення надійшов хворий з профузним поносом і блювотою. В лабораторію особливо небезпечних інфекцій направлений матеріал - блювотні маси, в яких виявлені Гр- рухливі злегка зігнуті палички. Який метод діагностики був використаний? Поставте попередній діагноз, запропонуйте схему подальшого дослідження.

2. З фекалій хворого на гастроентерит виділена культура, схожа з холерним вібріоном за морфологічними і біохімічними ознаками, але вона не аглютинується О-холерною сироваткою. Які додаткові дослідження треба провести, щоб довести, що виділена культура є холерним вібріоном?

3. У місцевості, у епідемічному відношенні неблагополучної за холерою, досліджені два колодязі з питною водою. В одному з них виявлений холерний бактеріофаг Ель-тор 2, в іншому холерні фаги не виявлені. Дайте висновок про можливість використання води з цих колодязів.