Вопрос 43: Иммунологические методы

Это  диагностические лабораторные  методы, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител.  Широко  используются  для  выявления  возбудителей  инфекционных  и паразитарных  заболеваний,  определения гормонов,  беременности,  видовой принадлежности  белков,  опухолевых  антигенов,  диагностики  аутоиммунных   болезней,     для  определения  групп  крови  и  совместимости  переливаемой  крови.  Иммунологические  исследования  позволяют  не только  идентифицировать  различные  вирусные, бактериальные или   паразитарные заболевания,  но  также  определять  титры  антител к ним,  что  позволяет   оценивать   устойчивость  организма  к  отдельным  видам  инфекционных  болезней и  прогнозировать  их  развитие.   С  помощью  иммунологических  методов  изучают  иммунитет  по отношению к массовым инфекциям,  например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

В  основе  этих  методов  исследований  лежит  реакция  «антиген-антитело»   с  образованием  иммунных  комплексов,  которые  можно  обнаружить  в  сыворотке  крови  (в  пробирке)  различными  методами.

Антиген - это вещество, которое «узнается» организмом животного как чужеродное, и которое может запускать иммунную (защитную) реакцию.  Антигенами  могут  быть  бактерии, вирусы,  грибы, паразиты,  а  также  любые другие  вещества  из  внешней  или  внутренней  среды   (пыльца растений,    белки  трансплантатов   тканей   и  органов,  поверхностные  белки клеток крови при  ее  переливании  и  другие  соединения).  В  некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов.    Одним  из  главных  способов,   с  помощью  которого  организм  защищается  от  проникновения  антигенов,   является  выработка  антител.  

Антитела   (иммуноглобулины — IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)  - это белки, которые образуются клетками организма животного в ответ на внедрение в него антигена.   Антитела образуются  против не  всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившие название антигенных детерминант. Наиболее важным свойством антител является их способность специфически (то есть избирательно) связываться с антигеном. Это означает, что каждое антитело «узнает» и связывается только с  одним  определенным антигеном.  Кроме  этого  возможно  получение  искусственным  путем  антител,  которые  будут  специфически  связываться  с  другими  антителами, что  широко  используется  для  создания  различных  диагностических  тест систем.  Сыворотка  крови,  содержащая  антитела  к  другим  антителам  называется  антисывороткой. 

Таким  образом,  высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа. 

С  помощью  иммунологических  исследований  решаются  две  основные  задачи:

1. Определение  антигенов.  Когда  неизвестным  компонентом  реакции  является антиген. Для его  обнаружения в  исследуемом  материале  используют диагностические иммунные сыворотки крови, содержащие  высокоспецифичные  антитела, которые  были  получены от животных после их вакцинации определенными антигенами. 

2. Определение  антител.  В этом случае неизвестен состав антител в сыворотке крови. Их определяют по взаимодействию с заведомо известными антигенами (диагностикумами – стандартными препаратами, используемыми в качестве антигена в  иммунологических  или,  как  их  еще  называют, серологических реакциях). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител (иммуноглобулинов), специфичных  к  примененному антигену.

При   исследовании  антител  к  инфекционным  заболеваниям,  например  к  лептоспирозу  или  токсоплазмозу,  достоверные результаты получают при исследовании «парных» проб сывороток. Сначала  анализируют кровь  больного,   взятую  в первые дни заболевания. Затем, через 10 – 14 дней, изучают повторную пробу  и  на  основании  динамики нарастания антител  ставят  окончательный  диагноз. 

 Иммунологические  реакции  протекают  в  две  фазы:

1. Специфическое связывание   антител и антигенов. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут.

2. Неспецифическое проявление реакции, характеризующееся внешними признаками образования иммунных комплексов антиген-антитело.  Эта фаза может развиваться в течение нескольких минут или часов.

Внешние проявления некоторых реакций зависят от свойств антигена (размеры частиц, физико-химическое состояние), класса и вида антител, а также условий проведения теста (консистенции среды, концентрации солей, рН, температуры), в том числе от методов постановки «меток» на образовавшийся иммунный комплекс.

В  зависимости  от  механизма  и  учета результатов   иммунологические методы  исследования  подразделяют  на:   реакции,  основанные  на  явлении  агглютинации;  реакции,  основанные  на явлении преципитации;  реакции с участием комплемента;  реакции нейтрализации,  реакции с использованием химических и физических методов (иммуноферментный  и  иммунофлюоресцентный  анализы).

Реакция  агглютинации. 

В этой  реакции  антигенами  являются  крупные  частицы  - микробные  клетки,  эритроциты, лейкоциты  и  т.д.,  которые склеиваются антителами и выпадают в осадок  на дно пробирки  в  виде  иммунных комплексов в форме хлопьев или зерен, видимых невооруженным глазом.   Это  возможно  благодаря особенностям строения  молекулы  антител, которые  имеют форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками - по одному на конце каждой из двух “ветвей”. Связывание антигенных детерминант приводит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участков два, они могут сшивать антигены.   Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок.  На  этом  основано  определение  групп  крови и  совместимости  переливаемой  крови  перед  гемотрансфузией,  когда  эритроциты  склеиваются  антителами  той  или  иной  специфичности. 

При  диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух направлениях:

1.  определяют вид выделенного от больного животного микроба-возбудителя с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки,  содержащей  специфические  антитела;

2.  обнаруживают антитела в сыворотке больного животного, используя стандартный микробный диагностикум,  включающий  антигены.  Титром агглютинирующей  сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена.

Для  обнаружения   лептоспироза  у  животных  и  человека  используют  реакцию  микроагглютинации  (РМА), которую  проводят    на специальных  планшетах  в  микрообъемах.  При  этом  легко наблюдать  образование клеточного  осадка  на  дне  лунки.

Отличаясь  чувствительностью,  реакция  агглютинации  также  используется  для  идентификации  антител  к  растворимым,  мелкодисперсным  антигенам.   В  этом  случае  она  называется  реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации  (РНГА).   Для  этого  антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах или частицах латекса.  Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки крови, содержащей антитела к данному антигену.

Реакция  преципитации.

Преципитация  или  осаждение  иммунных  комплексов  происходит   вследствие взаимодействия антител с растворимыми антигенами.   В  результате  чего  происходит  их  агрегация, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата).  Различные разновидности реакции преципитации  проводят  либо  в  жидкой  среде,  либо  чаще  всего  в  твердых  гелях агара.  Метод,  основанный на  реакции  преципитации,  также  называется  методом  иммунодиффузии. 

Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки, вырезанные  в  агарозном  геле, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.   Этот  метод   используется  для  диагностики  инфекционного  гепатита  у  животных. 

Иммунологические  методы  с  использованием  химических  и  физических  меток. 

Эти  методы  обладают  высокой  чувствительностью  и  специфичностью,  и  нашли  широкое  применение  в  лабораторной диагностике болезней  животных  и  человека. 

Иммунофлюоресцентный анализ   основан на использовании  антител  меченных флюоресцирующими веществами  (флюорохромами).  Меченые антитела связываются с антигеном, образуя  иммунные комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии.  Этот  метод  часто  используют  в  иммуногистохими,  т.е.  для  определения  локализации антигена  в  клетках  и тканях.  При  этом  можно  установить  распределение  антигена  в  тканях  и  клетках.  С  другой  стороны  иммунофлуоресценция  позволяет  обнаружить  антитела,  направленные  к  известному  антигену  данной  ткани  или  клетки.  Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа:  прямой, непрямой  и  конкурентный.