2. Системи месенджерів.

Необхідно зазначити, що вторинні месенджери мають ряд особливостей. По-перше, це-відносно невелика, порівняно з біополімерами Мм, оскільки треба з великою швидкістю дифундувати у цитоплазмі. По-друге, має дуже швидко розщеплюватись, а у випадку з кальцієм- відкачуватись, оскільки сигнальна система не може залишатись у ввімкненому стані тоді, коли дія сигналу вже закінчилась.

Внутрішньоклітинні сигнальні шляхи, що починаються від мембранного рецептора (Ташмухамедов)

Насьогодні одна із систематизацій шляхів трансдукції сигналів може бути заснована на певних вторинних месенджерах, які беруть участь у сигнальних каскадах:

1) цАМФ опосередковані шляхи

2) цГМФ опосередковані шляхи (незалежні від NO)

3) цГМФ і NO-опосередковані шляхи

4) шляхи, опосередковані іонами Са²⁺, ДАГ і інозитолтрифосфатом

5) шляхи, опосередковані іншими похідними ліпідів

6) шляхи, опосередковані малими G-білками

7) шляхи без залучення системи вторинних месенджерів

Історично, першим вторинним месенджером було відкрито циклічну АМФ (цАМФ)- Сазерленд (1957) і першим каскадом, який було вивчено, був са­ме каскад, що активується циклічними нуклеотидами. Зв'язування ре­цептору із специфічним лігандом приводить до приєднання до цього рецептору так званого G-білка (гуаніннуклеотидзв'язуючого білка). Нагадаємо, що ці G-білки пов'язані з роботою цАМФ-залежної і фосфатидилінозітольної системи трансдукції сигналу (основні ефектори G-білків – аденілатциклаза=АЦ і фосфоліпаза С=ФЛС), виконують функцію трансмітерів, передаючи сигнал від рецептора всередину клітини. Утворений комплекс активує аденілатциклазу, що перетворює АТФ на цАМФ. [Гормон -регульовані АЦ є трансмембранними глікопротеїдами, які активуються системою G-білків, що активно співпрацюють з системою рецепторів (GPCR), пов’язаних з G-білками. Ці рецептори належать до найбільшого класу поверхневих молекул, залучених у трансдукцію сигналу; складаються з 7 α-спіралей-7ТМ. G-білки є гетеротримерами і складаються з субодиниць α, β, γ, причому α- субодиниці є активуючими (α_s) і інгібуючими (α_i), тобто роботу аденілатциклази по різному регулюють два види білків (G_s та G _i). Зв’язування сигнальної молекули з рецептором стимулює структурні перебудови G-білка, що в свою чергу приводить до втрати спорідненості α до ГДФ та заміну її на ГТФ, подальше найчастіше вивільнення α·ГТФ з комплексу з субодиницями β, γ, латеральна дифузія в мембрані до зустрічі з АЦ та активація (інгібування) мембраннозв’язаної АЦ. Завдяки власній ГТФазній активності Gα каталізує розщеплення ГТФ до ГДФ і фосфату, після чого активізуються зворотні описаним вище процеси).

цАМФ активує протеїнкіназу А (ПК-А), яка фосфорилює білки по залишках серину та треоніну і таким чином активує їх. Повернення до неактивованого стану відбувається за допомогою цАМФ-фосфодіестерази, що перетворює цАМФ у 5´-АМФ, і фосфатази, яка дефосфорилює активований білок. Слід відмітити, що в процесах активації значну роль відіграє і дефософорилювання - для повернення системи у початковий стан і здатності її сприймати наступні сигнали. Система цАМФ працює в адренорецепторах, дофамінових, гістамінових рецепторах, рецепторах до адено­зину, простагландинів, вазопресину, глюкагону.

Далі було відкрито, що подібним вторинним месенджером є і цГМФ. Він утворюється під дією гуанілатциклази. Цитозольний форма цього ферменту активується монооксuдами NO, CO i OH, які на думку ряду авторів разом з церамідом, фосфатидною кислотою, циклоаденозинмонофосфат-рибозою належать до родини вторинних посередників. цГМФ активує іншу протеїнкіназу - ПК-Г, яка фосфорилює інші, ніж ПК-А білки (теж по залишках сери­ну і треоніну).

До початку 80-х років каскади цАМФ і цГМФ були найбільш вив­ченими і вважалися за головні. Однак пізніше було з'ясовано, що існу­ють і інші каскади і в імунних клітинах саме вони відіграють голо­вну роль у передачі сигналу від антиген-специфічних рецепторів. Го­ловним із цих каскадів виявився поліфосфоінозитидний (вторинні месенджери - Са²⁺, ІФ₃).

Отже на початку 90-х років 20 ст. було показано, що саме Са²⁺, поліфосфо-інозитидний каскад відіграє провідну роль у передачі сигналу від антиген-специфічних рецепторів у клітинах імунної системи.

Ключовим ферментом цього каскаду є фосфоліпаза С (ФЛ-С), яка активується після зв’язування рецептора із специфічним лігандом. Активація цього ферменту, що міститься на внутрішній стороні плазмолеми, залежить від його ізоформи. Для ФЛ-С_β характерним трансмітером є G-білок.

Для антиген-специфічних рецепторів імунних клітин є характерною ФЛ-С_γ, яка у клітинах вищих хребетних також поділяється на дві ізоформи С_γ 1 і С_γ 2.

Перша ізоформа експресована у клітинах усіх типів, а друга- тільки в імунокомпетентних. Отже останні мають обидві форми фосфофоліпази С_γ. ФЛ-С_γ в неактивному стані не прикріплена до мембрани, а вільно дифундує у цитозолі. Тому у процесі дифузії молекули ФЛ-С_γ можуть опосередковано зв’язуватись з антиген-специфічним рецептором і бути фосфорильованими по залишкам тирозину специфічними тирозиновими кіназами - виконавцями трансміттерних функцій.

Таким чином на рівні активації сигналінгу з залученням Т- і В- клітинного рецептору одним з механізмів є рекрутування внутрішньоклітинних білків до плазматичної мембрани шляхом тирозин-залежного фосфорилювання власне рецептора, так і скафолдних і адапторних білків (I). Другий механізм – активація мембрано-асоційованих G-білків, які рекрутують сигнальні молекули до мембрани (II). Третій механізм – локальне утворення модифікованих мембранних ліпідів в результаті активації рецепторів (III).

I. Тирозинові кіна­зи, що беруть участь у передачі сиґ­налу від антигенспецифічного рецептора Т- і В-клітин, поділяють на чотири (п’ять) родини за спільними ознаками будови та гомоло­гією амінокислотних послідовностей. Слід підкреслити, що всі тирозинові кінази, крім каталітичного, мають консервативні доме­ни, які визначають взаємодію кіназ з пев­ними субстратами, а також їх локалізацію в сигнальному комплексі.

Зараз ми розглянемо доменну структуру сигнальних білків, до яких належать тирозинові протеїнкінази, фосфоліпаза Сγ ( PL Cγ), фосфоінозитид- 3 кіназа (РІ3К), адапторні білки і т.д.

Фосфоліпаза С містить

SH 2, SH3 і РН – домени.

Фосфоінозитид-3-кіназа

(РІ3-кіназа) містить

SH 2, SH 3, РН і Тес – домени.

дописать

рис. 6.2

SH1 (Src homology 1)-домен- - каталітичний домен.

SH2-домен- зв'язування з пептидними послідовностями, що містять фосфорильовані тирозини.

SH3 –домен- зв'язування з пептидними послідовностями, що збагачені високим вмістом проліну.

SH 4- домен- зв'язування з плазматичною мембраною.

РН-домен- pleckstrin homology- зв'язування, зокрема з фосфоліпідами клітинної мембрани та з протеїнкназою С=ПКС (фосфоінозитиди). Плекстрин - білок тромбоцитів, який є субстратом для ПКС.

ТН домен –Тес homology- містить послідовності з високим вмістом проліну.

1. Тирозинові кінази родини Src (Lck, Fyn, Yes, Src, Lyn, Blk). Див рис. Src is the product of the cellular protooncogene of the Rous sarcoma virus-oncogen. Вони мають унікальний N-кінцевий домен з міристильованим залишком гліцину (рідше - пальмітинової кислоти). Залишок жирної кислоти сприяє тому, щоб кінази Src були зв'язані з плазматичною мембраною. Насьогодні вважають, що білки, залучені у трансдукцію сигналу, організовані у мембранні структури= LIPID RAFTS. Тирозинові кінази родини Src є специфічними для певних клітин і для певних ступенів розвитку iмунних клітин. Так, було показано, що кіназа Lck, яка конститутивно асоційована з цитоплазматичними доменами корецепторних молекул СD4 та СD8, бере участь в розвитку Т лімфоцитів. Кіназа Fyn, навпаки, працює тільки в зрілих клітинах і слабо асоційована з цитоплазматичним доменом ζ-ланцюга комплекса СDЗ.

Саме ці кінази взаємодіють з IТАМs і фосфорилю­ють їх по залишках тирозину. Як вже зазначалось кінази Src-родини, як правило, нековалентно сполучені з цитоплазматичною час­тиною корецепторів Т- і В-клітин. У Т-клітинах вони перебувають в асоціації з мо­лекулами СD4 або СD8 (залежно від субпопуляції Т-клітин), а у В-клітинах — з корецепторним блоком, що складається з трьох субодиниць — СD19, СD21 та ТАРА. Наближення корецептора до рецептора під час розпізнавання антигену призводить до того, що кінази Src-родини розміщуються біля послідовностей ІТАМ і фосфорилюють їх.

Т -лімфоцити містять в основному Lck, Fyn,

В-лімфоцити- Lyn, Blk, Fyn.

2. Кінази Csk-родини. Csk-родина тирозинових кіназ у клітинах імунної сис­теми представлена однією кіназою Csk (від англ. С terminal Src kinase — кіназа С-кінця Src) — негативним регулятором кіназ Src-родини. За своєю будовою Csk нагадує кінази Src-родини, однак вона не має залишку тирозину на С-кінцевому «хвості» і міристинової кислоти на N-кінці молекули. Тому вона є цитоплазматичною кіназою і постійно перебуває в активова­ному стані. Тобто у випадку фосфорилювання С-кінцевих тирозинів у молекулі Src за участі Csk- кінази Src є неактивними.

Активація кіназ родини Src (рис.6.15). Як було встановлено Src-кінази містять SH 2, SH3 домени, що передують кіназному SН1 домену. В інактивованому стані кіназний домен обмежений взаємодією з обома SH2, SH3 доменами, які стримують активність домену SН1. Власне SH2 домен взаємодіє з фосфорильованим тирозином на С-кінці кіназного домену, а SH3 домен взаємодії з пролін - збагаченим лінкером (між SH2 і кіназним SH1 доменом). Вивільнення SH2 або SH3 домену може активувати кіназну активність. Дефосфорилювання С-кінцевого тирозину фосфатазою CD 45 приводить до вивільнення SH2 домену і активації кінази. А також зв’язування ліганда з SH3 доменом приводить до вивільнення останнього від зв’язку з кіназним доменом і активації ферменту. А фосфорилювання цього ж тирозину Csk- кіназами або втрата SH3 ліганда повертає Src-кіназу в інактивований стан.

Фосфорилювання Src кіназ контролюється фосфатазою СD45. Цей білок є в усіх клітинах крові крім еритроцитів. Таким чином, активність тирозинової кінази, що знаходить­ся безпосередньо під рецептором, залежить від балансу актив­ностей фосфатази СD45 і кінази Сsk. Про важливість такої взає­модії для нормальної життєдіяльності клітини свідчить той факт, що СD45 складає до 10% всіх поверхневих білків Т лімфоциту.

3. Кінази родини Syk/ZAP-70. Syk працює в В лімфоцитах, а ZАР-70 ( ζ – chain – associated protein) в Т лімфоцитах. Ці кінази не мають у своєму складі жир­них кислот і не зв'язані з мембраною. Вважають, що вони приймають естафету від Srс кіназ: взаємодіють із фосфорильованими ІТАМs і передають сигнал далі на адапторні білки. Харак­терною ознакою кіназ цієї родини є на­явність розміщених один за одним двох SH2 – доменів.

За допомогою тандему з двох SH2-доменів кінази Syk/Zap-70-родини здатні специфічно взаємодіяти з двома фосфорильованими тирозинами, що входять до складу ІТАМ. По суті, фосфорильовані послідовності ІТАМ є специфічними сайтами для взаємодії з кіназами Syk/Zap-70-родини. Після того як кінази Src-родини фосфорилюють цитоплазматичні час­тини СD3 або Іgα/Іgβ, до цих частин приєднуються кінази Syk/Zap-70-родини. Так, було показано, що Zap-70 приєднується до ζ-ланцюга СD3 і фосфорилюється і активується кіназою Lck.

4. Кінази Януса: Jak 1, 2, 3 і Туk2 працюють iз іншими рецепто­рами імунних клітин - рецепторами для ростових факторів і інтерлейкінів.

5. Кінази Тес-родини. Представники кіназ Тес-родини за будовою дуже нага­дують кінази Src-родини, однак, на відмі­ну від останніх, вони не містять N-кінцевого залишку міристинової кислоти. За­мість нього у них є N-кінцевий РН-домен. РН-домени здатні приєднуватися до мем­брани під час взаємодії з ФІФЗ, тому кіна­зи Тес-родини можуть знаходитися як у цитоплазмі, так і в контакті з мембраною клітини, залежно від наявності у клітинній мембрані ФІФЗ. Отже, при активації в клітині РІЗ-кінази, яка утворює ФІФЗ, кінази Тес-родини приєднуються до мембрани і залучаються в процес передачі сигналу.

У пацієнтів із тяжкими формами імуно­дефіцитів, наприклад з хворобою Брутона, знайдено мутації в генах, що кодують кінази Тес-родини (Btk). Функ­цією кіназ цієї родини є активація фосфоліпази Сγ, причому різні представни­ки Тес-родини активують різні ізоформи фосфоліпаз.

У Т-клітинах знайдено щонайменше три представники кіназ Тес-родини — Тес, Itk і Rlk/Тхk. У В-клітинах найважливішу функцію в процесі передачі сиґналу виконує інший представник цієї родини — кіназа Btk.